培养基一般采用高压蒸汽灭菌法.ppt

* 实验原理 根据某种细菌的营养需要而选择多种原料配制而成的培养基，不仅含有这种细菌生长繁殖所需要的各种营养物质，还要有适宜的pH。本实验所用的牛肉膏蛋白胨培养基，应用较广泛，适于芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等多种细菌的培养。 配制好的培养基必须经过灭菌。灭菌是指杀死一定环境中所有微生物的细胞、芽孢和孢子。对不同的材料，应当采取不同的灭菌方法。培养基一般采用高压蒸汽灭菌法，就是将待灭菌的培养基放入密闭的高压蒸汽灭菌锅内，通过加热使锅内的水沸腾并产生水蒸汽。当水蒸汽将锅内的冷空气排尽以后，关闭排气阀并继续加热，这时锅内的压力就会升高，最终使菌体蛋白质凝固变性，从而达到灭菌的目的。接种环是用火焰烧灼灭菌的。 将某种细菌接种在彻底灭菌的培养基上，经过一段时间的培养后，就能够得到生长良好的细菌群体，它们在培养基上会呈现出一定的形态特征。 目的要求 1．通过对牛肉膏蛋白胨培养基的配 制，了解配制培养基的一般步骤和方法。 2．了解灭菌的基本原理，以及实验室中常用的灭菌方法。 3．初步学会细菌培养的基本技术。 材料用具 芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌、牛肉膏、蛋白胨、琼脂。 天平、角匙、200mL烧杯、试管、漏斗、量筒、玻璃棒、滴管、胶管、弹簧夹、铁架台、酒精灯、石棉网、三角架、火柴、纱布、棉花、牛皮纸、线绳、标签、接种环、精密pH试纸(或pH计)、金属小筐、高压蒸汽灭菌锅、恒温箱。 NaCl、1mol/L的NaOH溶液、体积分数为75％的酒精溶液、蒸馏水。 方法步骤 一、培养基的配制 1．称量 用天平称取0.5g牛肉膏、1g蛋白胨、0.5gNaCl、2g琼脂。将称好的牛肉膏、蛋白胨和NaCl放入烧杯。 2．溶化 向上述烧杯中加入蒸馏水100 mL，用玻璃棒搅匀后，放到酒精灯上加热。当牛肉膏和蛋白胨溶化后，加入琼脂，并继续用微火加热。在琼脂溶化的过程中，要控制火力的大小，并且不断搅拌，以免培养基溢出或烧焦。待琼脂完全溶化后，补加蒸馏水至100mL。 3．调pH 用滴管逐滴滴入1mol/L的NaOH溶液，边滴边搅拌，并随时用pH试纸测pH，直到pH为7.4～7.6为止。 4．培养基的分装 按右图所示，将培养基趁热分装到洁净的试管中，培养基的高度约为试管高度的1/5。注意：分装时不要将培养基沾在管口和试管上段，以免引起污染。 5．加棉塞 培养基分装完毕以后，在管口上加一个棉塞。棉塞能防止杂菌污染，保证通气良好。加棉塞时，应使棉塞长度的2/3在试管口内，如下图所示。 例：在叶绿体色素提取和分离与利用牛肉膏蛋白胨培养金黄色葡萄球菌二个实验中，①装色素滤液的试管和②接种培养基的试管均要用到棉塞。下列有关①和②所用棉塞的特点及其作用的说法，正确的是（ ） A、二者用的都是脱脂棉，可以防止水分吸附 B、二者的都不是脱脂棉，有利于水分的吸附 C、②所用的棉塞应该比①更紧，以防杂菌污染 D、①所用的棉塞应该比②更紧，以防滤液蒸发 D 6．包扎 每10支试管用线绳捆成一捆，并且在管口外面包上一层牛皮纸，然后，用线绳扎好。在每捆试管外挂上标签，注明培养基名称、配制日期和制作者姓名 二、灭菌 1．打开高压蒸汽灭菌锅，将里面的灭菌桶取出，向锅内加水(最好用开水)，水面与底架平齐为宜。高压蒸汽灭菌锅的构造如右下图所示。 2．将扎好的试管管口向上竖放在灭菌 桶内，再将灭菌桶放回灭菌锅。注 意：灭菌桶内的物品不能放得太 挤，否则会影响灭菌效果。 3．加盖，并将排气软管插入灭菌桶的排气 槽内。以两两对称的方式，同时旋紧相 对的两个紧固螺栓，以防漏气。 4．排出锅内的冷空气。接通电源，当压力 上升到49kPa时，打开排气阀放气，当压 力降到0时，关闭排气阀。重复上述放气 过程一次，以彻底排出锅内的冷空气。 5．当锅内的压力上升到98kPa时，控制火 力大小，使压力维持在98kPa左右 20min，切断电源。 6．当压力降至0以后，打开排气阀，10min 以后，旋松紧固螺栓，取出试管。最后， 将灭菌锅里的水排放干净。 三、搁置斜面 当培养基冷却至50℃左右时，将试管带棉塞的一端搁在一根木棒上。搁置的长度要合适，使培养基形成的斜面的长度不超过试管总长的一半。 四、接种 1．用肥皂将双手洗净，擦干，再用 酒精(体积分数为75%)棉球擦拭 双手。 2．当手上的酒精挥发完毕后，点燃 酒精灯。注意：一定要等手上的 酒精挥发完毕后，再点燃酒精 灯，否则，容易将手烧伤。