工程菌K19脂肪酶的酶学性质研究实验设计.doc

工程菌K19脂肪酶的酶学性质研究实验设计 1、实验背景 脂肪酶在微生物中分布很广，据统计，细菌有28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其他真菌23个共计达65个属的微生物产脂肪酶［2］。在产脂肪酶的微生物当中，由于真菌的脂肪酶多为胞外酶，较易分离提取，而真菌又易于培养，因此在酶制剂工业中深受青睐。由于我们所研究的是作为酶制剂，需要对该酶进行酶学性质的研究。在过程中不可避免地出现的如过程中的温度，对酶制剂的应用效果产生影响，因此就需要进行酶的热稳定性的研究。，pH耐受性研究。作为，多种无机离子，对酶活性有一定的影响，研究金属离子对酶活的影响。 ⑴实验器材 三角瓶、接种环、恒温摇床、酒精灯、滴定管、微量加液器、高压灭菌锅、电泳仪、离心机、水浴锅等 ⑵实验试剂 聚乙烯醇、橄榄油、酚酞、、、丙酮、75%乙醇、20%乙醇、去离子水、考马斯亮蓝R-250、冰醋酸、（Tris）[5]、乳糖、酵母粉、蛋白胨、等）Φ03，20℃，130min底物的配制：橄榄油乳化液称取g聚乙烯醇，加蒸馏水mL，加热并搅拌，至聚乙烯醇全部溶解。橄榄油，用高速组织捣碎机搅动分钟，即成乳白色聚乙烯醇橄榄油乳化液，保存于低温下(4)备用。有效期一周。 最适温度的测定 以为底物，在pH.5，25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、5℃、55℃、6℃、70℃下反应10min，测定。 温度为5℃，pH 3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11.0下10min，pH条件 pH稳定性的测定 同样以橄榄油乳化液作为底物，将脂肪酶在45℃的最适温度下，选取三个pH梯度，最低pH、最适pH和最高pH下保温，每30min测量一次酶活力，记录数据。 ③金属离子对酶活力的影响 将脂肪酶与各种不同的金属离子K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+和Co+混合，终浓度为1mM，在最适条件下反应10min，测其酶活力。同时以不加金属离子测定的酶活力为对照，记录数据。 ④ 甲醇对酶活性的影响 甲醇浓度对酶活力影响 将甲醇与脂肪酶酶液按0:1、0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1和5:1混匀后，把混合物1mL加到反应体系，最适条件下反应10min测定酶活力，记录数据 。 不同时间下甲醇对酶活力的影响 将脂肪酶和甲醇按1:1比例混合，最适条件下测定脂肪酶酶活力，不同时间梯度10min、20min、30min、40min、50min、60min、90min、120min、150min和180min测定酶活力，记录数据。 参考文献 ［1］胡长浩，施文芳，沈麟，林琳。脂肪酶菌种的筛选、鉴定及酶学性质研究.生物技术.2009,19（2）：53-57 ［2］罗珊珊，戴大章，夏黎明. Penicilium expansum PED-03固态发酵产脂肪酶及酶学性质研究.食品与工业微生物.2006,32（3）：14-17 ［3］李红宁，杨滟菊.一株耐热脂肪酶产生菌XD-23的酶学性质研究.湖北农业科学.2011,50（9）:1773-1775 ［4］于玉凤，陆兆新等.高效产脂肪酶菌株C1的分离鉴定与酶学性质研究.湖南农业科学.2010（23）：31-33 ［5］姜锡瑞，段钢．新编酶制剂实用技术手册[M]．北京：中国轻工业出版社．2002．