第12章节 体外培养细胞的转化.doc

第12章 体外培养细胞的转化 体外培养的细胞，由于环境因素的影响，有时会发生自发转化，由原来的正常二倍体核型变成多倍体\异倍体核型, 细胞的生长特性也随之发生改变获得永生化，失去接触抑制，可无限制繁殖传代。但这种自发产生的转化不仅时间长，而且转化率极低，介于10-4～10-6，需用大量细胞，成功的把握性不大，条件也难以控制，必须用人工诱发的方法。 人工诱发体外培养细胞转化，是在人工设计的诱变因素下使细胞发生转化，这就大大克服了自发转化中所存在的问题，不仅诱发因素已知，而且转化细胞所需时间短，通常1～3个月就可发现，转化率较高，这对研究癌变原理，研究可疑致癌因素的作用有很大的实用价值。因此，体外培养细胞的人工诱变的细胞转化实验已成为研究癌变机理、癌变因素的重要方法。 Ｓ12.1 细胞转化的基本概念和原理 一、细胞转化的基本概念 细胞转化是细胞发生遗传性改变而导致细胞永生化的转变方式，直接涉及细胞DNA或基因发生改变，这种变化可稳定地遗传下去，可代代相传，致使细胞的一系列生物学特性、生长特点都随之发生改变，由原来二倍体型的体外培养细胞的正常寿命为65±15代而转变成能够长期维持和生长繁殖。由限定性细胞系转变成连续性传代细胞系，能在体外进行无限制地传代和生长繁殖，获得了永生化。 二、细胞转化与恶变的区别 细胞转化或基因突变不一定就是癌变，因为细胞在体外培养的环境中受到一定诱变因素影响后，虽然会使基因诱发突变，使遗传特性、生长特性、生物学性状均发生了改变，获得了新的性状，失去了正常细胞的接触抑制和寿命限制，但经动物致瘤试验，却无致瘤性，说明转化的细胞并非就是恶性肿瘤细胞。细胞转化应分为一般转化和恶性转化两种方式，鉴于癌变的演变是分阶段的，故一般转化和恶性转化，可能是癌变过程中不同阶段的两种表现形式，癌的形成是细胞已完成了上述的所有阶段，而一般转化仅完成癌变开始的一两个阶段，由此可见，细胞转化与恶变(癌变)是有本质区别的。这已在许多实验中获得了证实。 三、细胞转化的方式 １．细胞自发转化 这是体外培养的细胞在无任何诱变剂存在的条件下，细胞自发出现的转化现象，即一种原因不明的转化现象。这种现象已在许多正常二倍体细胞长期传代过程中所证实，而且采用此方法也可建立长期培养的传代细胞系。说明体外传代培养的二倍体细胞在传代过程中由于受到环境中各种因素的影响，如血清质量、温度不恒定、pH不稳定、病毒污染等，均有可能失去正常细胞特性，而发生遗传变异甚至发生转化，因此，为了维持二倍体细胞的正常细胞特性，防止遗传变异和转化，应尽量早期冻存和减少传代。 ２．工诱发转化(人工诱变) 在体外培养的细胞中，常因化学、物理和生物等各种致癌因素的影响，而使细胞发生转化，为人工诱发细胞转化的诱变因素提供了依据。因此，人们可以用人工的方法设计出某一种已知诱变因素而使正常细胞直接受到致癌物的作用，使细胞发生恶性转化，在短时间内就可获得明确的实验结果(一般为1～3个月)，远比用动物诱变试验周期大大缩短，而且无外界其他因素和体内免疫因素的干扰，这对研究癌变原理和检测环境中可疑致癌因素、致癌作用提供实验依据，有很大的实用价值。 四、细胞转化的基本过程 １.诱发(Initiation)阶段 细胞转化是细胞在诱发因素的直接作用下而使DNA发生损伤，这是细胞转化的诱发阶段，在诱发试验中，首先要使诱变剂直接接触细胞，但剂量过大、作用时间过长细胞死亡，而使转化失败，其剂量和作用时间(6小时以上最高不超过24小时)应控制在能使细胞损伤而不致死的范围。 在诱发试验中的诱变剂种类很多，大致可分为物理、化学和生物(病毒)三种。物理因素，如放射线、温度、电磁波、药物等；化学因素，如甲基胆蒽、土醌80、7.12—二甲基苯醌(DMBA)、3-甲基胆蒽、甲基甲磺醌(MMS)、乙基甲磺酸(EMS)、乙基亚硝基脲(ENC)、甲基硝基亚硝基胍类化合物(N-Methy-Nitro-N-Nitrosoguanidine MNNG)等；生物因素，如毒素、黄曲霉素、病毒SV40、EB病毒、多发瘤病毒(Polioma)、逆转病毒等，这些因素都可引起细胞转化，发生癌变。由此可见，自然环境中一旦受到这些诱变剂的污染，将会成为人类癌发病率升高的致病因素。 除了上述诱变剂外，还有一种促进癌变的促癌剂(Promotor)，本身无诱癌作用，但具有增强和促进细胞转化的作用，如TPA(12-0-Tetradecanoyl-Phorobol-13-Acetate,TPA)又称十二癸豆寇，属单纯促癌剂，即只有促癌而无致癌作用，这可能与TPA促进细胞在生长因子信号传导系统中，具有类甘油二酯作用，能激活蛋白激酶(PKC)促细胞增殖所致。 在化学致癌诱变剂中还有一种间接致癌物，又称前致癌物，需经过某些酶的活化，形成终末致癌物后，通过该物中强的