细胞基因敲除--crispr-cas9技术流程.pdfVIP

CRISPR/Cas9技术基本流程 基因组编辑（Genome Editing ）步入Cas9 的时代 专业的CRISPR/Cas9 介导的knock-out 和knock-in 就 在南京尧顺禹 ！ 025南京尧顺禹 CRISPR/Cas9 技术基因改造专家 南京尧顺禹—CRISPR/Cas9 技术专业服务公司 一、CRISPR/Cas9 技术介导的基因敲除和敲入 1、基本原理 CRISPR/Cas9 靶向基因改造（敲除、敲入）技术是最新发展起来的 一种强有力的用于基因组编辑（genome editing ）的分子生物学工具， 现已广泛应用于人、大鼠、小鼠、斑马鱼、果蝇、家蚕、线虫、酵母、 拟南芥、烟草、高粱、水稻和小麦等各类动植物个体或细胞基因组的 遗传学改造。相较于TALEN （Transcription Activator-Like Effector Nuclease ）技术， CRISPR 技术的效率要高得多，而且采用CRISPR 技术可以一次性的对 多个基因同时进行基因敲除和/或敲入 （Science, 2013, 15 February, p. 823 ）。而 先前担心CRISPR/Cas9 技术的脱靶问题，最近已有美国马萨诸塞州坎 布里奇博大研究所（Broad Institute in Cambridge, Massachusetts ）的合 成生物学家张丰（Feng Zhang ）通过使用带有点突变的Cas9 完全解决（Cell. 2013 Sep 12;154(6):1380-9 ）。美国哈佛大学的 George Church 认为， CRISPR/Cas9 技术的高效率和易用性将是其它已有基因组改造技术包 括TALEN 等所无法匹敌的（Science. 2013 Aug 23;341(6148):833-6 ）。 CRISPR （Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats ），即成簇规律 间隔的短回文重复序列。Cas9 蛋白是一种能够降解 DNA 分子的核酸 酶（nuclease ），其中含有两个酶切活性位点，每一个位点负责切割DNA 双螺旋中的一条链。CRISPR 在大约 40% 的细菌和 90% 的古细菌 （archaea ）的基因组中均有存在，它依赖crRNA (CRISPR RNA 能够与tracrRNA 配对，形成双链RNA 结构，这种双链RNA 分子能够介导Cas9 核酸内切酶对与双链RNA 分 1 025南京尧顺禹 您的CRISPR/Cas9 技术基因编辑专家 子互补结合的DNA 序列进行切割) 和tracrRNA (trans-activating chimeric RNA, 即反式激 活嵌合RNA ，一种非编码RNA ，能够促进 crRNA 的形成，是Cas9 蛋白发挥RNA 介导的DNA 切割作用必不可少的辅助因子)对外源 DNA 进行特异的识别，然后使用 Cas9 对外源DNA 进行序列特异性地切割降解，从在细菌和古细菌细胞发挥 了一种获得性免疫的作用。利用这一细菌获得性免疫的工作原理，美 国加州大学伯克利分校（University of California, Berkeley ）的生化学家 Jennifer Doudna 研究团队将tracrRNA 和空格 RNA （spacer RNA ）组合起 来，形成一个所谓的“向导RNA”分子（single-guide RNA ：sgRNA ），然后将 其与 Cas9 蛋白混合在一起，成功地对特定的 DNA 位点进行了切割 （Science , 17 August 2012, p. 816 ）。由于sgRNA 是通过其中的20 核苷酸特异 识别目标基因，设计起来非常方便，因此，在这一里程碑式的研究论 文发表后，CRISPR 技术得到了迅猛的发展。自2013 年 1 月起，大量 的有关利用CRISPR 技术的文章发表在Science、Nature 和Cell 上，形 成了一个CRISPR 热潮。由于CRISPR 系统是以 RNA