贯叶连翘提取物中总黄酮含量测定的研究.ppt

贯叶连翘提取物中总黄酮含量测定的实验研究 甲组 组员：何琨 武文斌 刘伯石 严中骏 金彦 李翔 吴迪 指导教师：洪战英 比色法测定总黄酮含量 比色法测定的原理是什么？ 为什么要用比色法测定？ 1、实验目的 掌握中药质量标准的制定、验证方法。 2、仪器与试药 UV-2450 岛津紫外分光光度仪；万分之一电子分析天平；超声清洗仪。 芦丁对照品（中国药品生物制品鉴定所 批号：100080-200707 供UV法测定含量为92.5%）；贯叶连翘乙醇提取物；甲醇（分析纯）；0.0997mol/L AlCl3甲醇溶液（现用现配），蒸馏水。 3、方法与结果 3．1 对照品储备液的制备： 精密称取芦丁对照品10.0mg两份分别置于两个100ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，作为对照品储备液(0.0925 mg/ml )。 3．2 供试品储备液的制备： 精密称取贯叶连翘乙醇提取物 0.2014g，置于100ml磨口锥形瓶中，加40ml甲醇超声溶解，冷却至室温后，转移至100ml容量瓶中定容 (2.014mg/mL)，过滤，滤液转移至100ml容量瓶中。 3．3 比色法测总黄酮含量 3．3．1 测定波长选择 精密量取对照品储备液1.50ml，置于25ml容量瓶中，加甲醇至刻度。得芦丁对照品溶液A； 精密量取供试品溶液1.00ml，置于25ml容量瓶中，加甲醇至刻度。得供试品溶液B； 精密量取对照品溶液1.50ml，置于25ml容量瓶中，加AlCl3甲醇溶液1.0ml，摇匀，加甲醇至刻度，摇匀，放置20min。得芦丁AlCl3对照品溶液C； 精密量取供试品溶液1.00ml，置于25ml容量瓶中，加AlCl3甲醇溶液1.0ml，摇匀，加甲醇至刻度，摇匀，放置20 min。得芦丁AlCl3供试品溶液D； 25ml容量瓶中加AlCl3甲醇溶液1.0ml，摇匀，加甲醇至刻度，摇匀，放置20min。得空白对照溶液E。 A B E溶液以甲醇为空白对照；C D溶液以甲醇和AlCl3溶液混合溶液为空白对照，以甲醇为空白对照标定基线，在200~600nm波长范围内扫描 。 选择测定波长的原则 本次试验在测定波长的选择上以对照品为标准。在波长选择试验中，无论是紫外法还是比色法，对照品的最大吸收波长和供试品的最大吸收波长都有差距。紫外法中对照品最大吸收波长为257nm和358nm，供试品紫外吸收曲线呈下坡状，354nm处有小峰。比色法中对照品最大吸收波长为433.5nm，供试品最大吸收波长423nm。 考虑到不知供试品中含有成分的确切种类，为避免干扰，选择了对照品的最大吸收波长为检测波长。在仪器误差之外，考虑到供试品中有最大吸收的不是芦丁成分，有可能是其他黄酮类物质，也有可能是杂质。 3．3．2 标准曲线的制备 6个 25 ml容量瓶中，分别精密量取2.00ml （7.40μg/ml） 2.50ml（9.25μg/ml） 3.00ml（11.10μg/ml） 3.50ml（12.95μg/ml） 4.00ml（14.80μg/ml） 4.50ml（16.65μg/ml）对照品储备液，分别加AlCl3甲醇溶液1.0ml，摇匀，加甲醇至刻度，摇匀，放置20min。以甲醇和显色剂混合液为空白对照标定基线，以甲醇和AlCl3溶液混合溶液为空白对照在在200nm-600nm处扫描，取433.5nm波长处测定值记录。在7.4μg/ml~16.65μg/ml得出回归方程，相关系数和线性图。 3．3．3 耐用度考察 以甲醇和AlCl3溶液混合液为空白对照标定基线，精密量取供试品溶液3.00ml 置于50ml容量瓶中，于 10min 20min 30min 40min 50min 1h 2h 4h 按“样品的测定”方法测定其吸光度。 从实验结果观察，应选40min为显色时间，但参考已知数据并考虑时间用时问题，选择20min为显色时间。 3．3．4 重复性考察 精密量取供试品储备液1.00ml六份，分别置于6个25ml容量瓶中，加AlCl3甲醇溶液1.0ml，摇匀，加甲醇至刻度，摇匀，放置20min。以甲醇和AlCl3溶液混合液为空白对照标定基线，在200nm-600nm处扫描，取433.5nm处吸光度值记录。 重复性实验再次验证了，供试品的最大吸收波长为422.5nm，而非433.5nm。 3．3．5 加样回收率考察 精密量取对照品储备液1.50ml，供试品储备液0.70ml，置于25ml容量瓶中，加AlCl3甲醇溶液