双水相萃取脂肪酶ppt课件.ppt

双水相萃取脂肪酶 双水相萃取脂肪酶 概述：本实验主要研究用双水相萃取法分离和提纯脂肪酶的技术，探究了双水相的形成条件及不同浓度的双水相体系对脂肪酶的提纯效果。 黄酮类化合物的提取和分离 黄酮类化合物的提取和分离 为了得到适合的两相配比，就要通过绘制相图来进行分析，相图的绘制就是通过调整两相比例，得到能够分相的临界点，从而得到相图。 脂肪酶经过双水相的初步分离后，还要通过凝胶过滤的方法对其进行进一步的分离和纯化，从而达到更高的纯度。但是经过双水相后，体系中有大量的PEG（脂肪酶主要分配在PEG相）从而不能直接经过凝胶过滤，还需要采取一定手段去除过量的PEG，可以采用PEG沉淀的方法或者反萃取来去除多余的PEG。 本实验采用的是PEG/（NH4）2SO4体系和SDS/CTAB体系两种双水相。PEG/（NH4）2SO4体系是较为常用的一种双水相体系， SDS/CTAB体系是一种表面活性剂双水相体系， 黄酮类化合物的提取和分离 实验材料：假单胞菌脂肪酶（由假单胞菌发酵制备） 实验仪器：紫外可见分光光度计，离心机，乳化机，恒温摇床，恒温水浴锅，PH计 黄酮类化合物的提取和分离 PEG1000、（NH4）2SO4、十二烷基硫酸钠（SDS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、橄榄油、2%聚乙烯醇（PVA）溶液、糊精、蛋白胨、 K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O，0.05mol/L NaOH溶液，酚酞指示剂，EDTA,pNPP,乙腈 黄酮类化合物的提取和分离 黄酮类化合物的提取和分离 原理：酚羟基与碱成盐，溶于水；加酸后析出 碱： 常用Ca(OH)2，即石灰乳(石灰水) 黄酮类化合物的提取和分离 优点 A：使含酚羟基化合物成盐溶解。 B：使含羧基杂质（果胶、粘液质、蛋白质等） 形成钙盐沉淀。 注意 a：提取时，碱液浓度不宜过高。 b：加酸酸化时，酸性也不宜过强。 应用：芦丁和槲皮素等的提取、分离和鉴定。 黄酮类化合物的提取和分离 原理：活性炭吸附黄酮苷类化合物 用途：主要用于含量较高的黄酮苷类的精制 黄酮类化合物的提取和分离 极性 氢键 分子大小（量） 酸性 特殊结构 黄酮类化合物的提取和分离 硅胶是一种高活性吸附材料，其化学分子式为mSiO2·nH2O 应用范围： 主要分离小极性和中等极性的化合物，应用最为广泛。 异黄酮、二氢黄酮（醇）、高度甲基化（乙酰化）的黄 、 酮及黄酮醇。 多羟基黄酮、黄酮醇及其苷类：硅胶加水去活化。 吸附规律： 极性大吸附能力强 e g ： A 苷元 B 二糖苷 C 单糖苷 Rf：A C B 黄酮类化合物的提取和分离 原理：氢键吸附（作用） 洗脱规律：（先→后） 母核上游离羟基增加，越难于洗脱。 羟基数目相同时，有缔合羟基 无缔合羟基 苷元相同：三糖苷 双糖苷 单糖苷 苷元 不同类型黄酮类化合物的洗脱先后顺序为： 异黄酮＞二氢黄酮醇＞黄酮＞黄酮醇 分子中芳香程度高、共轭双键多，则聚酰胺对其的吸附力强，故难于洗脱。 应用范围：适合各种类型的黄酮类化合物，包括苷、苷元、查耳酮及二氢黄酮。 正相与反相色谱 硅胶 固定相（硅醇） 流动相（醇）极性时为正相 聚酰胺 固定相（聚酰胺脂肪链） 流动相（醇水）极性时为反相 黄酮类化合物的提取和分离 常用型号：Sephadex-G和Sephadex-LH20 原理：吸附作用和分子筛 对游离黄酮，主要是吸附作用, 吸附程度取决于游离酚羟基的数目，苷元的羟基数目越多，越难洗脱。 对黄酮苷，主要是分子筛原理, 洗脱时按分子量由大到小先后洗脱下来。 常用洗脱剂： 碱性水溶液（0.1mol/L NH4OH），盐水溶液(0.05mol/L NaCl) 醇及含水醇，如甲醇，甲醇-水，乙醇等。 其它溶剂：含水丙酮、甲醇-氯仿(凝胶会膨胀， 体积变大)。 黄酮类化合物的提取和分离 规律： 苷元的羟基数越多，越难以洗脱。 吸附作用 苷的分子量越大,其上联结糖的数目越多,容易洗脱。 分子筛原理 苷比苷元先洗脱。 黄酮类化合物的提取和分离 原理： 黄酮类化合物具有酸性、且不同数目和不同位置的酚羟基的酸性强弱不同。 适用范围：适用于分离酸性强弱不同的黄酮苷元 黄酮类化合物的提取和分离 黄酮类化合物的提取和分离 原