DNA分型技术原理PPT.pptVIP

DNA分型的步骤 提取DNA PCR扩增 毛细管电泳 数据处理 一、DNA 提取 应用聚合酶链反应（PCR）技术测定临床标本中的病原体核酸成分，是一种高度敏感，且最为直接的检测手段。由于临床标本中含有蛋白质、脂类等物质，可干扰PCR反应，故在做PCR反应前必须进行核酸提取。 临床常见的标本有血清（浆）、全血、分泌物、棉拭子、脓液、体液、新鲜组织、石蜡切片等，这些临床标本的处理和保存方法各有不同。 DNA提取的方法 样本 Chelex法 酚/氯仿 磁珠 硅胶膜 FTA卡 Chelex方法 1.Chelex-100提取DNA Chelex是一种以亚氨二乙酸为吸附因子的苯乙烯与二乙基苯的共聚物，对多价金属离子有螯合作用，可防止DNA在煮沸加热前被降解，同时在高温低离子强度下还有催化DNA释放的作用。这样既可减少DNA的损失，又可削除扩增中的一些抑制因素。 基本方法：沉淀细胞；5%试剂200μl；56℃0.5h以上；100℃8min；剧烈震 荡；离心上清。 注意： 离心彻底。 酚/氯仿法 原理： 通过酚-氯仿混合物萃取 DNA溶液中的蛋白质类有机物质，而保留 DNA 于水相溶液 中。 优点： 适用所有生物检材，提取 DNA 分子结 构完整，特别适合 RFLP、测序等需要大分子 DNA分析技术。 磁珠法 利用磁性硅胶吸附白细胞，用细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的DNA分子被吸附到磁性颗粒表面，蛋白质等分子不被吸附而留在溶液中。在磁场作用下，磁性颗粒与液体分开，回收颗粒，再用纯水或TE洗脱吸附的DNA。 DNA分型技术原理 背 景 DNA指纹或DNA分型是英国遗传学家Alec Jeffreys在1985年首次提出的。 Jeffreys博士发现DNA的某些区域具有重复序列，并且序列重复的数目存在个体差异，通过开发检测这些DNA重复序列长度变化的技术，开创了个体身份识别的新局面。 DNA长度多态性的分类 长度多态性： 等位基因片段长度的个体差别。由一特定序列，首尾相连串联重复次数不同产生的个体差别。 分为： 可变数目串联重复（variable number of tandem repeat, VNTR） 短串联重复(short tandem repeat, STR) VNTR和STR的区别及命名 A：产生原因：DNA滑动与同源染色体不等交换。 B： 差别： STR VNTR 重复序列组成 2-7 bp 7-数十bp 重复序列数目 2-10数个 10数个-数百个 鉴别能力 高 极高 优势扩增现象 不明显 极明显 检测灵敏度 极高 稍差 片段总长度 200-500 bp 数千以上bp C：STR的命名： 非编码区-D3S1358 D3 第三号染色体 S 单拷贝（single copy） 1358?? VNTR序列的发现序号 STR分型 STR，short tandem repeat,短串联重复序列，微卫星（microsatellite），SSR (simple sequence repeat) 结构特征：序列重复，分为简单重复（simple）和复杂重复（complex） 分布于基因之间 STR基因座命名原则 STR在人类基因组中分布广泛 HGP带来更多STR认识 目前被鉴定出的4核苷酸重复超过20，000个(Collins et al. An exhaustive DNA micro-satellite map of the human genome using high performance computing. Genomics 2003;82: