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大豆根瘤共生固氮分子机制研究进展 　　摘 要：大豆的共生固氮能力得益于根瘤，根瘤数与固氮效率是典型的数量性状受多基因调控。目前，已经在大豆中克隆到?Y瘤因子（Nodular Factor，NF）的关键受体，以及一些在结瘤信号传导途径中的分子组分，这些组分涉及到结瘤基因、肽类激素、受体激酶和小的信号代谢产物。其中部分基因的功能及作用机理得以阐明，参与的共生固氮途径及部分节点也已明晰。 　　关键词：大豆根瘤；共生固氮；机制研究；进展 　　中图分类号：S-1 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20171132011 　　共生固氮是一个极其复杂的生物过程，它是由根瘤菌与寄主植物互作产生的，主要过程为寄主根部产生类黄酮，吸引根瘤菌附着于根毛，产生并释放NF，被寄主的NF受体识别，产生钙峰信号―结瘤信号，根毛变形弯曲包裹根瘤菌，根瘤菌侵入后通过宿主植物中所形成的一些管状结构达到宿主根的皮层，形成侵入线。随后，皮层细胞进行有丝分裂，继而形成根瘤原基。经过发育，成熟的根瘤即可固氮，当根瘤达到一定数量时寄主会产生信号“Q”，传导到茎，茎部受体接收信号，产生细胞分裂素，传导回根部，终止结瘤[1]。在这个过程中，涉及到寄主植物的多个基因，主要包括调控根瘤原基形成的基因、参与根瘤发育的基因、根瘤自我调控途径基因以及固氮相关的基因。 　　1 调控根瘤元基形成的基因 　　经过攻关已初步解析了豆科植物根瘤形成的遗传机制。现已在百脉根、苜蓿、大豆中克隆了NF受体1（NFR1）和受体5（NFR5）基因，为编码跨膜的Lys-M-型丝氨酸/苏氨酸受体激酶。在百脉根中发现一个与NFR5互作的小GTP酶ROP6，其对侵入线形成及结瘤过程均具有正调控作用[2，3]。NFR1和NFR5形成异源二聚体接收NF，启动一系列的下游信号转导级联反应，包括质膜上受体激酶（DMI2、SYM19、NORK）的表达，以及离子通道蛋白（DMI1）等的表达，从而诱导钙峰的产生以及根毛的弯曲变形[4，5]。依赖钙离子蛋白的激酶（DMI3）和GRAS-家族转录因子NSP1和NSP2基因也被克隆，处于NFR和DM2、DM1等基因的下游对胞质 Ca2+浓度变化产生响应[6]。转录因子NIN也在侵染线和根瘤原基中起着重要的作用，它可能与NSP1和NSP2联合在一起，共同调节表皮中结瘤基因的表达和结瘤过程[7]。 　　除了钙离子通道蛋白参与信号转导外，在百脉根中发现共生信号钾离子通道蛋白基因：2个同源基因Castor和Pollux，它们可以弥补钾离子渗透所产生的电荷不平衡，是细胞核周围钙离子激增所必需的，其中Castor 定位于核膜上[8]。这项成果表明：除了上述根瘤共生体信号通路元件，还存在其他与共生体相关的信号元件。无论结瘤信号怎样传导，最终都会使早期结瘤基因ENOD40表达，进而形成根瘤。ENOD40基因编码含12个氨基酸的多肽A和24个氨基酸的多肽B。多肽A 通过二硫键共价与蔗糖合酶93ku亚基上的一个半胱氨酸结合，多肽B的结合位点尚不清楚。蔗糖合酶是蔗糖代谢的重要组成部分，蔗糖的裂解是植物固氮的关键一步，也是根瘤形成的先决条件[9]。 　　2 参与根瘤发育的基因 　　根瘤原基形成后，通过发育可以分别形成无效根瘤和有效根瘤。Rj2控制大豆与根瘤菌USDA7、USDA14和USDA112发育形成无效根瘤。无效结瘤Rj2基因广泛存在于我国东北大豆中，无效结瘤率为64%，导致大豆植株干重及根瘤固氮酶活性下降，并产生缺绿病。显性基因Rj4也控制大豆与根瘤菌USDA33发育形成无效根瘤。目前通过精细定位及原位克隆已获得该基因Glyma.01g165800-D，其编码类甜蛋白。通过CRISPR/Cas9-based基因编辑敲除该基因，有效根瘤数显著增加[10]。通过对大豆基因组分析及根瘤不同发育时期转录组测序，周新安课题组（2016， 2017）获得了调控根瘤发育基因Glyma.15G227500[11]和延迟根瘤衰老的基因Glyma18g12240[12]，均编码半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Cystatin）。通过基因过表达分析，转Glyma.15G227500的植株根瘤数增加，转Glyma18g12240的根瘤衰老减慢。 　　目前已在百脉根中克隆到的调控根瘤发育的基因，包括硫酸盐转运蛋白、锚蛋白重复结构域蛋白、无效结瘤基因、高柠檬酸合成酶、铁转运蛋白、突触融合蛋白、柠檬酸盐转运蛋白、外排蛋白等基因 [13，14]。但基因间的互作及调控机制仍未知。在苜蓿中克隆到的调控根瘤发育基因分别为Kruppel-like 锌指蛋白、HLH类转录因子、ERF类转录因子Mt-EFD、C2H2类转录因子Mt-RSD [15]。其中，Mt-RSD在苜蓿结瘤后6d在根瘤中特异表达，且在的侵染