细胞转化核酸序列分析以及基因人工合成表达定点突变和PCR扩.PPT

设计合成了12种由11个或12个连续的脱氧胸苷酸加上两个3‘-端锚定脱氧核苷酸组成的3引物，用以反转录mRNA，合成第一链cDNA。每一种人工合成的寡核苷酸引物，都能够把总mRNA群体的1/12分子反转录成mRNA-cDNA杂合分子。 从一对不同的组织或器官中分离总mRNA，分别称为A组和B组。 ? 图5-29 DDRT-PCR反应的基本程序。 cDNA差示分析法 (RDA, Representation Difference Analysis) 通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异性扩增目的基因片段。 4碱基切割酶处理Tester和Driver，形成平均为256 bp的代表群，保留了绝大部分遗传信息。 每次T减D反应后仅设置72℃复性与延伸，94℃变性这两个参数共20个PCR循环，PCR产物的特异性和所得探针的纯度高。 Gateway大规模克隆技术 Gateway技术利用λ噬菌体进行位点特异性DNA片段重组，实现了不需要传统的酶切联接过程的基因快速克隆和载体间平行转移。 Gateway大规模克隆策略 TOPO反应: 将目的基因PCR产物连入Entry载体。载体上的CCCTT被拓扑异构酶所识别，通过与切口处的磷酸基团形成共价键，将该酶偶联在载体上。5’GTGG粘性末端攻击PCR产物的互补性末端并与接头序列CACC退火，使PCR产物以正确方向连入E