贝那普利及其活性代谢物贝那普利拉的衍生化LCMS同时测定.ppt

;方 法 特 点;第一部分; 文献报道贝那普利口服后吸收迅速，消除快，其在体内经肝脏水解生成有活性的二元羧酸代谢物——贝那普利拉，代谢过程见下图。;代谢; 据文献报道，贝那普利（Ⅰ）和贝那普利拉（Ⅱ）都能够与血管紧张素转化酶竞争性结合，使全身外周血管舒张，降低血管阻力而产生降压作用，因此，同时测定贝那普利和贝那普利拉的血药浓度，对研究两者的药代动力学具有较高的参考价值。 ; 但从Ⅰ和Ⅱ的化学结构式和条件的预摸索发现，如果Ⅰ和Ⅱ未经任何化学结构修饰而直接以LC/MS法同时测定其血药浓度，那么我们将会遇到以下三个问题：;3、Ⅱ以LC/MS法测定时灵敏度不高，达不到该药的药代动力学灵敏度要求，而Ⅰ 的灵敏度较高。 ;仔细研究Ⅰ和Ⅱ的化学结构式发现，;（1）Ⅰ和Ⅱ甲酯化后，两个衍生物化学结构式之间只相差一个亚甲基，极性相近，有利于同时测定； ;（4）Ⅱ甲酯化后，脂溶性增强，一方面易被非极性有机溶剂提取出来，另一方面增强了色谱保留，从而有利于避开血浆中极性物质的干扰。 ;衍生化;衍生化试剂选择 羧基化合物的甲酯化试剂可采用甲醇制盐酸(硫酸）溶液或重氮甲烷乙醚溶液。甲醇制盐酸(硫酸）溶液的反应时间长，不适于微量合成。重氮甲烷活性强，反应产率高，几乎可达100％，反应时间短，对一元酸、二元酸均能有效甲酯化，可用于微量合成， 很适合于血浆中Ⅰ和Ⅱ的甲酯化。;衍生化试剂重氮甲烷的制备 ;甲酯化反应 ;I.S.;甲酯化产物的确证;[M+H]+;[M+H]+ ;甲酯化衍生物的色谱保留和灵敏度;小结;条件的选择;Fragmentor 电压的选择; 结果以峰面积计得Ⅰ和Ⅱ各自衍生物的[M+H]+ 离子在电压为100V时响应最高，故选择100V测定样品。; Ⅰ和Ⅱ极性强，以常规的液-液萃取法处理时回收率极低，而以固相萃取法处理血浆时，文献报道回收率不高，而且操作繁琐、耗时。为了快速、简便地进行血浆样品前处理，我们先是将血浆样品直接与重氮甲烷-乙醚溶液反应、萃取，但结果回收率低、重现性差，原因可能是含有大量羧酸的血浆中蛋白质干扰了Ⅰ和Ⅱ与重氮甲烷的反应。于是我们将血浆去除蛋白后，再进行衍生化反应。 ; 然而，去除蛋白的血浆上清液由于含有水，难以全部吹干，而且即使全部吹干，所得的回收率也很低（小于50%）。于是我们只吹去大部分较易吹干的有机层，只剩余约0.5 ml难于吹干的水层，再与重氮甲烷-乙醚溶液进行反应。结果回收率得到了提高，重现性也满足生物样本分析要求。 ; 由于蛋白沉淀试剂不同，空白血浆的干扰情况、样品的回收率都会不同，所以需要选择一个适当的蛋白沉淀试剂。 三种血浆处理方法均无内源性物质干扰样品的测定，而且以乙醇处理的样品响应最高。;血浆样品酸碱度的选择 ;衍生化反应时间的选择;流动相水相pH的选择 ;水相中醋酸铵浓度的选择 ;小结;质谱条件：仪器：Agilent 1100 LC/MSD；工作站：Agilent ChemStations；离子检测方式：SIM ；离子极性：Positive ；离子化方式：气动辅助电喷雾离子化；Fragmentor电压：100 V；检测对象： [M+H]+ 离子，m/z 439.3，m/z 425.3，m/z 391.3；毛细管电压：4000 V；干燥气流速：10 L·min-1；干燥气温度：350℃；雾化气压力：40 psig 。;DI.S.; Ⅰ和Ⅱ的标准曲线分别在0.990～396 ng·ml-1 、0.993～397 ng·ml-1 范围内线性良好，相关系数 r 0.99。 LLOQ分别为0.990、0.993 ng·ml-1 。;方法学小结与讨论;Benazepril;单剂量服用10 mgⅠ·HCl后的Ⅰ的药代动力学参数 (mean ± SD, n = 20);单剂量服用10 mgⅠ·HCl后的Ⅱ的药代动力学参数 (mean ± SD, n = 20); 由于盐酸贝那普利口服吸收后在体内经肝脏水解生成活性更强的贝那普利拉，故本实验以贝那普利拉作为生物等效性的评价指标。 评价结果表明我们试验的受试制剂与参比制剂具有生物等效性。