食品营养与检测职业学院毕业论文-饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力测定.docxVIP

毕 业 论 文（设计）题 目饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定指导老师张波专业班级食品营养与检测122姓 名 薛雨霖学 号201271002132015年 5月 28日摘要：蛋白酶在一定的温度和pH条件下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比。通过在660nm测定其吸光度，计算出蛋白酶活力。本实验确定了样品的提取液为蒸馏水、底物酪蛋白用量为1mL、样品的稀释倍数（酸性蛋白酶为1500-2500，中性蛋白酶为500-2000），并对样品中酸性和中性蛋白酶活力的稳定性进行测定，测得的稳定性较高。本方法测得的两种样品的标准偏差均小于10%，因此该方法具有良好的精密度。关键词：饲料添加剂；酸性和中性蛋白酶；酶活力目 录引言11 材料和仪器11.1原料11.2 仪器设备11.3主要试剂12 实验方法22.1 主要试剂的配制22.1.11mol/L及0.1mol/L的盐酸溶液的配制22.1.20.4mol/L的碳酸钠溶液的配制22.1.3福林试剂的配制22.1.4pH3.5乳酸缓冲液的配制22.1.5pH7.0的磷酸缓冲液的配制22.1.61.0%酪蛋白溶液的配制22.1.70.4mol/L的三氯乙酸溶液的配制32.1.8L-酪氨酸标准溶液的配制32.2样品酶液的制备32.3酸性和中性蛋白酶活力的测定方法32.4计算43 结果与分析43.1 标准曲线绘制43.2实验条件对饲料蛋白酶活力的影响53.2.1样品提取液对酸性蛋白酶活力的影响53.2.2底物酪蛋白用量对酸性和中性蛋白酶活力的影响63.2.3不同稀释倍数的样品酶液对酸性和中性蛋白酶活力的影响63.2.4对酸性和中性蛋白酶活力稳定性的测定7结论7参考文献8引言蛋白酶是饲料工业中比较常见的一种饲用酶，蛋白酶是可以使蛋白质水解成α-氨基酸的酶，蛋白酶分为酸性酶、碱性酶、中性酶，酸性酶适宜pH值为2-5，产生该酶的微生物主要有黑曲霉、根霉、米曲霉；中性蛋白酶的最适宜pH值为7左右，活力值最高时约在4-50℃，主要由霉菌和细菌产生，其测定分析方法主要有福林显色法、紫外光谱法。因其紫外分光光度测定法的检出限和定量限都显著低于福林酚法测定法，本文使用福林显色法测定两种酶的活性，其原理是蛋白酶在一定的温度和pH条件下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比。通过在660nm测定其吸光度，计算出蛋白酶活力。本实验采用福林显色法对饲料蛋白酶活力进行测定，摸索福林酚法测定蛋白酶的条件。并对反应条件进行优化，以提高测定的准确性。1 材料和仪器1.1 原料 含酸性蛋白酶的饲料,含中性蛋白酶的饲料。1.2 仪器设备Lambda-20型紫外可见分光光度计(美国Pekin-Elmer公司)、Sartorious BS 223S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)、HHS-4型电热恒温水浴锅、精密pH计、秒表等。1.3 主要试剂1mol/L及0.1mol/L的盐酸溶液、0.4mol/L的碳酸钠溶液、福林试剂、pH3.5的乳酸缓冲液、pH7.0的磷酸缓冲液、1.0％的酪素溶液（干酪素由杭州微生物试剂有限公司生产）、0.4mol/L的三氯乙酸溶液 、100μg/mL L-酪氨酸标准溶液。2 实验方法2.1 主要试剂的配制2.1.11mol/L及0.1mol/L的盐酸溶液的配制取浓盐酸85mL,加水稀释并定容至1000mL，即为1mol/L盐酸溶液；取100mL1mol/L盐酸溶液，定容至1000mL，即为0.1mol/L盐酸溶液。2.1.2 0.4mol/L的碳酸钠溶液的配制称取无水碳酸钠42.4g，用水溶解并定容至1000mL。2.1.3 福林试剂的配制于1000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（NaWO4.2H2O）100g、钼酸钠(Na2MoO4.2H2O)25g、水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL。小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风厨中加入硫酸锂（Li2SO4）50g，加水50mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15min，以除去多余的溴（冷却后仍有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却后加水定容至1000mL。混匀过滤。试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。使用时，以1份福林试剂与2份水混匀，制成稀福林试剂。2.1.4 pH3.5乳酸缓冲液的配制甲液：称取80%-90%乳酸10.6g,加水稀释并定容至1000mL。乙液：称取70%乳酸钠16g，加水稀释并定容至1000mL。使用溶液：取甲液2份，加乙液1份，再准确稀释1倍。用pH计调整pH至3.5,