植物组织组织培养中污染的控制.doc

植物组织组织培养中污染的控制 韦 显 韩 (广西职业技术学院农业技术工程系2002级应生班 摘 要 植物组织培养中经常出现不同程度的污染问题，造成很大的损失，因此控制污染是植物组织培养苗工厂化生产中重要的技术环节。本文作者从一般的污染的控制、内源性污染的控制、继代培养中污染防治、减少培养基中的有机成分等方面，讨论了怎样减少组培中出现的污染问题，如：对于一般的污染来说，主要从操作环境、操作人员、仪器；对于内源性污染主要是从外植体预处理到外植体灭菌方法；对于继代培养污染的控制主要是从对无菌外植体进行检验和反复进行茎尖培养或分生组织培养；至于对培养基有机成分的减少措施主要是减去培养基中的VB1、VB6或除去培养基中的蔗糖这几方面加以论述。 关键词 植物组织培养，污染，防治 植物组培苗工厂化生产在我国发展速度很快，组织培养各方面的技术日渐完善。但在组织培养中常常出现不同程度的污染。据了解，很多学者在初代培养这一阶段，很难得到无菌苗，或者虽然在初代培养得到了无菌苗，但在继代培养时往往出现大量污染甚至全部污染。在市场竞争中，如何降低成本是提高经济效益的首要问题，组织培养中污染率的增加势必然引起组培苗成本的提高，经济损失大。因此，组织培养中降低污染率是工厂化生产中不可忽视的技术环节。 在植物组织培养过程中，存在两种类型的污染：一类是通常所说的污染，即外植体消毒不彻底，无菌操作和培养过程中，如：培养基、接种工具、接种室消毒不严格或操作不规范而导致的污染；另一类是内源菌污染，内源菌包括真菌和细菌，内源污染一般是指内源细菌所致的污染。具体预防和解决方法如下： 1 通常污染的控制 1.1 症状与来源 在培养过程中，培养材料附近经常出现黏液或混浊的水迹，并有发酵状泡沫。这大多是细菌性污染，主要是由于使用了未消毒好的工具及操作者呼吸时排出的细菌所引起的，或是操作人员的手接触了材料或器皿边缘所致；有时培养基上还会出现黄、白、黑等不同颜色的霉菌，这是真菌性污染，主要是由于接种室空气污染造成的。 1.2 操作污染和环境污染 操作污染和环境污染指真菌污染和细菌污染。真菌污染主要来源于环境，细菌污染主要来源于接种材料及工具。此类污染可通过如下措施加以克服： 1.2.1 改善环境条件 每次接种前应对接种室的地面进行清洁卫生工作，并用75%的酒精喷雾使空气中的灰尘沉降，并用紫外线灯在黑暗中照射20~30分钟。接种前工作台面要用新洁尔灭或75%酒精擦洗,使用超净工作台对接种环境污染的控制更有成效。但它应置放在洁净的房间，窗户密封，并定期清洗过滤膜，以延长使用寿命。培养室的相对湿度应控制在70%左右，相对湿度太高时可以用抽湿机除湿。在接种结束时，应进行地面清洁卫生工作，即先打扫一遍，再用湿布擦过，并定期用甲醛熏蒸接种室。 1.2.2 无菌操作和无菌操作技术 工作人员使用的工作服、帽子、口罩等，要经常保持干净，并定期进行消毒。在接种前要剪除指甲，并用肥皂或洗衣粉溶液擦洗，最好再在新洁尔灭溶液中浸泡10分钟，后用75%的酒精擦手，并用75%的酒精擦拭母种瓶表面进行消毒，以防把微生物带进超净工作台。同时要求工作人员在接种时，最好不要感冒咳嗽和说话。污染中特别注意一种呈乳白色的细菌污染，这种细菌为芽孢杆菌。法国林木育种协会鉴定为迟缓芽孢杆菌，它外被荚膜，耐高温，一般消毒剂难以杀死。它可随培养材料、用具等传播；也可出现在培养基表面，或呈滴形云雾状存在培养基内，若出现时应严格灭菌，清洗和消毒用具，并更换消毒酒精。 操作人员操作动作要熟练、动作快、规范，这样可以缩短操作时间，减少污染。因为有很多组织培养的失败，从材料、培养基条件等方面检查均无问题，只是由于操作技术不熟练，如脱毒培养抽取茎尖很小，操作时间长了就会使茎尖失水变干，或不慎感染杂菌，再同时接种的环境又不是绝对无菌的。 1.2.3 严查接种材料 淘汰被真菌或细菌污染过的接种材。 1.2.4 经常检查消毒锅的灭菌质量 消毒锅的压力表降到零后不能马上出锅。因冷热空气作用的负压效应，使外界环境的冷空气倒吸入已灭菌好的培养瓶内引起真菌污染，为避免该现象的发生，消毒后培养瓶应留在锅里，等冷却后才出锅。如果出现培养基造成的污染，就要及时地检查灭菌锅的性能或其他的问题。 1.2.5 检查培养容器是否存在问题 培养容器封口多用塑料盖、胶塞、棉塞、薄膜等，塑料盖用久了易老化，密封性差，也会造成污染。同时，培养瓶在使用之前要洗净（包括瓶内瓶外），灭好菌的培养瓶不要放在空气中太久，一般出锅后1~2天内接完种最好，以减少培养瓶表面的微生物引起的污染。 2 内源性污染的控制 2.1 内源性污染的含义 在植物组织培养中，由于材料内部的内生菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料进