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液相色谱仪基础课程 PerkinElmer Demo Lab Training Center Shanghai HPLC 与 GC 的差异 液相色谱的分类 HPLC原理基础 范德母特(Van Deemter)方程式 1956年由J.J van Deemter提出 最初主要用在气相色谱(GC)上 经过改进，该方程式用到了液相色谱(LC)上 范德母特( Van Deemter)曲线及方程式 峰拖尾因子 管路连接 系统压力与溶剂比例关系 50%左右时的系统压力最高！ 手动进样器 结构 –7725i 手动进样器的进样准确性 手动进样器 合适的进样针 - 0.7mmOD-5.1cm平头针 正确的清洗方式 - 每进样10到20次清洗一次 液相色谱柱 色谱柱填料的物理性质 不同型号的ODS柱多环芳烃的分离 (a)HC-ODS(8.5%) (b)Lichrosorb RP-18(19.8%) (c)Partisil-10 ODS-2(16%) (d)Zobax ODS(10%) (e)u-Bondapak C18(10%) 化学键合相的液相色谱柱类型及应用 液相常用检测器 紫外检测器氘灯和钨灯的应用范围 流动相的影响 示差检测器 荧光检测器 二极管阵列检测器 其它检测器e.g. CDD, LSD, ECD, etc. 液相色谱操作注意事项 流动相准备 过滤，脱气 样品制备 样品溶液均要用0.45um的滤膜过滤 柱平衡 开机时流速从低到高 关机时流速从高到低 PH值 2～8 柱储藏 每次运行完后需要清洗色谱柱 液相色谱仪器保养 环境设置 HPLC的日常操作条件：温度：10～30℃；相对湿度80％； 最好是恒温、恒湿，远离高电磁干扰、高振动设备，有良好的通风设施 HPLC用水 专门的纯水机或超纯水机 去离子水重蒸 二次或三次重蒸水 采用类似家用的纯水机 市场上瓶装的纯净水或蒸馏水 其它途径 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质越高放置时间越短。 理想的HPLC用水应为18.2Ω的超纯水，并通过0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等 HPLC六通阀进样器的使用及保养 手柄不能停留在Load和Inject中途 暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀 在HPLC系统中使用平头注射器 针头外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性能好，不漏液，不引入空气 也防止了针头刺坏密封组件及定子 过滤样品溶液 防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损 每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗 用无纤维纸擦净注射器针头的外侧 液相色谱泵的保养 使用流动相尽量要清洁 进液处的砂芯过滤头要经常清洗 流动相交换时要防止沉淀 避免泵内堵塞或有气泡 每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染 液相色谱柱的保养 柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动 当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净 要注意流动相的脱气 避免使用高粘度的溶剂作为流动相 进样样品要提纯 严格控制进样量 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱 若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭 开泵和关泵的时候需要循序渐进！！！ 液相紫外灯的保养 在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器 样品池要保养 定量分析方法 校正因子 校正因子是定量计算公式中的比例常数，其物理意义是单位面积所代表的被测组分的量。 可用下式表示： Mi– I组分的量；fi– I组分的校正因子；Ai–I组分的峰面积 定量分析的依据是被测组分的量与响应信号成正比，但相同含量的物质由于物理、化学性质的差别，即使在同一检测器上产生的信号也不同，直接用响应信号定量，必然导致较大误差。故引入校正因子。 归一化法(Normalized %) 将样品中所有组份的含量之和定为100%。计算其中某一组份百分含量的定量方法： 其中：xi－试样中组份I的百分含量 fi－组份I的校正因子 Ai－组份I的峰面积或峰高 优点：方法简便，进样量与载气流速的影响不大 缺点：样品中所有组份必须都能出峰，并且必须知道各自组份的校正因子。 当样品中各组份的校正因子近似相等，可不用校正因子，将面积直接归一化，按下式计算： 即 % (NO Calibration) 外标法（External Standard) 在相同分析条件下，比较标准物质与样品的色谱峰面积或峰高 1. 用已知的标准品配