植物检疫性病害的检测及防除研究方法技术培训.ppt

提取液系列稀释 在金氏B（KB）培养基平板上涂布 在25℃和无光照条件下培养3d后 紫外光或近紫外光照射下有蓝色荧光的 菌落，为假单胞杆菌，可能是晕蔫病菌 选择典型菌落作进一步的鉴定 菜豆种传晕蔫病菌的分离 致病性测定：目的是区分致病性细菌和腐生菌。 过敏性反应(Hypersensitive reaction, HR)是指病原细菌在非寄主植物上引起枯斑反应的现象，腐生性细菌则不表现典型的枯斑。 大部分病原细菌，特别是 Pseudomonas属的病原细菌注射到烟草叶片上，能在24小时内产生枯斑反应。 接种方法 按照柯赫氏法则，从发病植物上得到的分离物，在健康的寄主植物上接种发病并与先前症状一致，然后再次从发病部位分离到与先前相同的分离物，才能证明该分离物是引致这种病害的病原物。常用的接种方法有喷雾、注射、针刺和浸泡等。 操作：细菌溢脓或分离纯化细菌――自然或人工接种――观察 针刺接种法接种甘蓝叶片中肋 如确系该菌，则接种部 位软腐、维管束褐变 切片置于1.5％水琼脂平板上， 在28℃和黑暗条件下培养3d 生理生化及快速测定法 生化测定试剂盒：鉴定某一类细菌的关键碳源、氮源、特殊酶和有机酸等并附有比较和检索用的计算机数据库。 Biolog 测定：美国Biolog 公司研制的专门鉴定细菌的专家系统。将大量的细菌生理生化测定参数与先进的计算机技术有机的结合起来。 噬菌体检测 噬菌体是感染细菌的病毒，能在活细菌细胞中寄生繁殖，破坏和裂解寄主细胞，在液体培养时，使混浊的细菌悬浮液变得澄清，在固体平板上培养时，则出现许多边缘整齐，透明光亮的圆形无菌空斑，称为“噬菌斑”，肉眼即可分辩。 噬菌体法的主要优点是简便、快速，能直接用种子提取液测定。 缺点是非目标菌多量存在时敏感性较差，噬菌体的寄生专化性和细菌对噬菌体的抵抗性都可能影响检验的准确性。 取10g稻种，脱下谷壳，剪碎或磨碎， 放入已灭菌处理的烧杯中 取10g稻种，脱下谷壳，剪碎或磨碎， 放入已灭菌处理的烧杯中 混匀后加入10ml融化的肉汁胨琼脂 培养基，摇匀凝成平板 在25-28℃温箱中，培养10-12h 记载各培养皿中的噬菌斑数，然后再 换算成每克种子的噬菌斑数 细菌的专化性噬菌体测定 酶联免疫吸附技术(ELISA)-- 酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunology assay, ELISA)是把抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机结合而发展起来的一种综合技术。 血清学检测技术 血清学检测技术 ELISA的测定方法:直接法、间接法、竞争法、酶抗酶法、双夹心法、双抗体夹心法等6种。 ELISA的特征:灵敏度高，特异性强，安全、快速并易观察。它可进行定性定量测定，适于大批量样品的检查、可用于病害普查，口岸检疫和产地检疫等。 双抗体夹心法 间接法 竞争法 免疫荧光技术 原理--将荧光物与微生物抗体结合得到荧光抗体，荧光抗体与相应的抗原结合，在荧光显微镜下发生荧光，以此来检测抗原。 免疫荧光技术有直接法和间接法两种，在实践中常用间接法，一抗与结合有荧光色素的二抗结合，通过免疫荧光显微镜来检测所发出的荧光。 免疫荧光技术 诊断试剂盒 分子检测技术 PCR检测技术是利用相应的引物，在DNA聚合酶催化下对目标DNA进行体外扩增，根据预期DNA条带的有无来判断检测的结果。 对检疫检验技术的要求 ①准确可靠，灵敏高度，能检出低量有害生物； ②快速、简单、方便易行； ③有标准化的操作规程，检验结果重复性好 ④安全，不扩散有害生物。 检验检疫的样品 同一国家和地区来源，同一运输工具，同一品名（种苗则为同一品种）的货物统称为一批，按批进行检验、放行或处理。 通常一批货物的数量很大，不可能全部检验，必须按规定的方法从批的总体中抽取适当数量的代表性部分，称为样品，用以检验。 每份送检样品量的规定：谷物、棉籽、瓜子、饲料类为1000g；大粒种子（玉米、蚕豆等）1000~1500g；小粒种子（芝麻）500g；蔬菜、烟草：10~100g；葱头、红枣、马铃薯等：2000~5000g。 取样方法的依据 有害生物的分布规律 货物的数量 装载方式等因素确定 样品数量（容量）大小依据 有害生物的带有率; 检验方法的灵敏度; 检验所要求的精度; 货物种类与特点; 检验所允许的时间和花费等许多因素确定。 有害生物的带有率越低，检验方法的灵敏度越低，检验精度要求越高，所需样品数量就越多。 检验检疫的方法 真菌主要由培养方法检出，根据形态特征鉴定； 细菌、病毒及与之类似的有害生物则需应用多种生物学的、生理生化的和免疫学的技术检验； 线虫和杂草种子主要由直接检验和机械分离而检出，根据形态特征鉴定。 第一节 植物病原真菌的检验检疫技术 病原真菌的属、种主要依据其形态特