发光的大肠杆菌课件.pptxVIP

发光的大肠杆菌 朱静宇 张明 石卉 制备感受态细胞 质粒扩增 质粒酶切 目的基因序列扩增 连接 转化 实验方案概述 材料 大肠杆菌 少量PET 28质粒（既为原核质粒又为真核质粒） 显示绿色荧光的PEGFP-N3质粒（为真核质粒） 制备大肠杆菌感受态细胞 挑取E.coil单菌落接种至2mlSOC 培养液，37℃摇床过夜。 挑取0.5—1ml过夜培养的菌液转种到50ml SOB 中，18℃剧烈震荡，直至A600达到0.6，取出水浴10min 4℃ 4000rpm/min 10min.同时冰浴配置TB溶液。 弃上清，倒置离心管于滤纸上 1mlTB溶液打散菌体沉淀，再加入15mlTB 溶液冰浴10-15min。4℃ 4000rpm/min 10min 去上清，沉淀重悬于4mlTB中，冰浴10min 加入280uL DMSO,混合均匀，冰浴10min 分装于EP管中，-80℃或液氮保存 检测感受态细胞的质量（阴性对照） 质粒扩增 pet28的质粒扩增 PEGFP-N3质粒扩增 摇菌 转化 提质粒 转化 取100ul感受态细胞于冰浴上融化 加入1ul pet28质粒和1ul PEGFP-N3质粒，轻轻吹匀，冰浴30min 将菌液放入42°C水浴热激90s，立即放入冰浴中2min 将菌液2000rmp/min离心3min，留200ul上清液将菌体打散，均匀涂布于含卡那抗性的琼脂平板，平板于37°C倒置培养过夜。 同时进行阳性和阴性对照 摇菌+提质粒 将培养过夜的平板取出，用已灭菌的枪尖挑取平板上单个的较大的菌落 将移液枪尖打入5ml培养基内，放入37°C摇床中 rpm/min,摇菌16小时左右 运用Omega等品牌的试剂盒对菌液进行小提 用浓度为1%的胶，120V 20min，用10000的marker做对照验证 测浓度 质粒的酶切 寻找pet28和pegfp-n3的酶切位点 质粒的酶切（两个质粒同时酶切） 确定的酶切位点：EcorR I、Xba I 内切酶：Not I、BamH I内切酶 Buffer：cutsmart 37℃ 温育 4hours 未酶切的质粒作对照，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果 纯化 01 02 03 04 05 06 设计引物 PEGFP-N3 目的基因扩增 PCR 电泳 胶回收 纯化 测序 PEGFP-N3目的基因EGF的PCR引物 PEGFPN5’  5TGGGAGGTCTATATAAGCAGAG3 　 PEGFPN3’  5’GTCGCCGTCCAGCTCGACCA3’ Primer 2 Tm 68.5 °C Molecular weight 6863.5 g/mol Extinction coeficient 181100.0 l/(mol˙cm) Primer #1 Tm 57.6 °C Molecular weight 6863.5 g/mol Extinction coeficient 229700.0 l/(mol˙cm)SXJ PCR 体系 premix体系 Taka Ra Taq dNTP mixture PCR buffer PEGFP-N3 100ng Primer 1 0.2-1.0uM Primer 2 0.2-1.0uM ddH2O 补足50uL PCR反应条件 95℃ 3min 98℃ 10s 60℃ 30s 72℃ 1min 72℃ 5min 4℃ ∞ 循环35次 02 01 03 加入样品与buffer 混匀，短暂离心 孵育 22℃ 3h 连接 01 02 03 04 05 质粒的转化 感受态细胞冰浴融化 加入质粒，混匀，冰浴 菌液热激90s后冰浴2min 加SOD，37℃摇菌 2000rpm/min 3min 涂布 涂布后，适当培养，挑取单克隆大肠杆菌菌落，进行检验。 挑菌落 镜检 在荧光显微镜下可看见发绿色荧光的大肠杆菌即为实验成功。