组胚实验课件（南京大学）0 注意事项及实验绪论.pptVIP

南京大学医学院 组织学与胚胎学实验指导 韩晓冬 王 yongwang@nju.edu.cn 李冬梅lidm@nju.edu.cn 丁卫东 二O一一年九月 实验须知 实验注意事项 分组 实验分一、二两组，人数各半。 组织学与胚胎学的研究方法 组织学与胚胎学的学习与研究主要涉及到两个方面：即显微镜观察和标本观察。 显微镜包括： 光学显微镜(light microscopy, LM)：常用于学习和研究组织学与胚胎学。 电子显微镜(electron microscopy,EM)：多用于组织学与胚胎学的研究。 (一)一般光学显微镜技术，组织切片的制作 应用光学显微镜观察组织标本(切片)是最常用的方法。 组织切片的制作：组织学切片制作比较复杂，基本包括以下几个步骤： 取材、固定、脱水、包埋、切片、染色等。 取材、固定：为了尽可能使所获得的材料的形态结构接近活体状态，取材要迅速，得到的材料应及时用固定液(fixative)加以固定(fixation)。常用的固定液为甲醛、乙醇等，它们可以使蛋白质迅速凝固，防止其分解和变性。 脱水、包埋、切片：为使组织与包埋剂相融合，所获得材料需经乙醇或丙酮脱水；为便于将材料切成薄片，则需将其包埋在石蜡或火棉胶等内，然后再用切片机将其切成薄片。一般切片厚约5～10μm。 染色：切片需经染色后方可在显微镜下观察。 苏木精、伊红染色 常规染色－苏木精(hematoxylin)、伊红(eosin)染色（简称HE染色）技术： 苏木精：是蓝色的碱性染料，可将细胞核和细胞内的某些物质染成蓝紫色； 伊红：是红色的酸性染料，可将细胞质染成粉红色。 对碱性染料亲和力强的称为嗜碱性(basophilia)； 对酸性染料亲和力强的称为嗜酸性(acidophilia)； 对两种染料亲和力都不强称中性(neutrophilia)。 甲苯胺蓝（toluidine）染色技术 甲苯胺蓝：是蓝色的碱性染料。 甲苯胺蓝将细胞内、外的某些物质染成紫红色。 这种染色现象称异染性(metachromasia)。 硝酸银、氯化金染色技术 硝酸银、氯化金颗粒可附着在细胞结构的表面而呈棕黑色或棕黄色 银染中，有些组织结构可直接使硝酸银还原而显色，称亲银性(argentaffin)。 银染中，有些组织结构不能直接使硝酸银还原，必须加入还原剂方能显色，称嗜银性(argentaffin)。 冷冻切片技术(frozen section method) 为避免细胞、组织内的某些物质不被固定液所破坏，又要使组织变硬，便于将其切成薄片，同时又要快速得到切片，可将获取的新鲜组织立即用冷冻切片机(cryostat)切成冷冻切片(frozen section) 。 这种方法制片迅速，细胞内酶活性保存较好，常用于酶组织化学染色。 其他技术 此外血细胞、分离细胞或脱落细胞可直接涂在玻片上（涂片）； 疏松结缔组织可撕成薄片铺在玻片上（铺片）； 牙和骨等坚硬组织可磨成薄片（磨片）； 以上标本再经固定染色后显微镜下观察。 电子显微镜技术 光镜：分辨率为0.2μm，放大倍数约为1000倍； 电镜：分辨率为0.2nm，比光镜高1000倍，可放大几万倍到几十万倍，因此电镜能观察到细胞的更微细结构。 在光镜与电镜下进行观察，常用的长度计量单位为毫米（mm）、微米（μm）和纳米（nm）。 这些单位间的关系如下：μm(微米)＝10-3mm(毫米)；nm(纳米)＝10-3μm(微米) 透射电子显微镜技术(transmission electron microscope) 透射电子显微镜技术的组织须用戍二醛或锇酸固定，树脂包埋，超薄切片(厚50～80nm），再经铅盐等重金属盐染色后，在透射电子显微镜下观察。 电镜下所见的结构称超微结构(ultrastructure)，被金属所染部位，荧光屏上显得暗，图象较黑，称为电子密度高；反之则称为电子密度低。 被检结构和重金属盐相结合的称正染色；被检结构本身不与重金属盐结合，而其周围染上重金属盐的称负染色。一般染色都是正染色。 扫描电子显微镜技术（scanning electron microscope） 扫描电子显微镜技术要观察的组织不需制成切片。 固定后的标本，在其表面喷镀金，在荧光屏上即可显示细胞或组织表面的立体结构，如细胞表面的突起、微绒毛、纤毛等。 冷冻蚀刻复型术(freeze etch replica) 冷冻蚀刻术：该技术包括冷冻、断裂、镀铂、分离复制面等主要步骤。 冷冻蚀刻术既可以看到细胞膜外表面，又可见细胞膜的内表面，也可探测细胞膜断面的结构。 一般组织化学 组织化学（histochemistry)方法是利用化学试剂与组织细胞内的某些物质呈现化学反应，在局部形成有色沉淀物