.PCR专题.ppt

PCR;原理 类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种变性-退火-延伸的过程就是一个PCR循环，这种循环能不断重复。 ;The PCR cycle;PCR process;;Principle of PCR;PCR发展速度 惊人，没有一种技术能与之相比 引用论文最多、应用范围十分广泛 1993年度诺贝尔化学奖：Mullis，与开创了“寡核苷酸基因定点诱变”加拿大籍英国科学家Michael Smith共获 ;procedures;Primer design Most imp. (1)length: 20～30bp (2)G+C contents:ATCG random distributed (3)primers : no complementary sequence (4)3‘end of the primer: no modification (5)5‘end of the primer:product length，can be modified (6) specificity:less than 70% homology with non-specific amplification sequence, or 8bp continuous complementary base;Primer designed with the help of computer DNA database conservative region comparision primers or blast ;Primes Store: 纯化引物在25％乙腈溶液中4℃；冻干引物于-20℃可保存1-2年，液体状态于-20℃可保存6个月。不用时应-20℃保存。 ;Buffer：10-50mmol/L Tris-HCl(pH8.3-8.8, 20℃) Mg2+：for Taq polymerase activity conc.:Low:low activity high: non-specific amplification dNTPs： 贮备dNTP液：1 mol/L NaOH 调pH至中性。 贮备浓度为5-10mmol/L，终浓度为20-200umol/L，分装-20℃保存。 4种dNTP浓度应相同。 ;Taq DNA聚合酶;Taq DNA聚合酶;Taq DNA聚合酶;PCR optimization 变性温度和时间 92-95℃，富含G和C的序列，可适当提高，但过高或时间过长都会导致酶活性损失。 退火温度与时间 引物中G、C含量高、长度长并与模板完全配对时，应提高温度。温度越高，产物特异性越高。通常37-55℃、1-2分钟。 延伸温度和时间 72℃，接近Taq酶的最适75℃;过长会导致产物非特异性增加。但对低浓度的目的序列，则可适当增加时间。 循环次数 循环过多，非特异性产物大量增加,一般25-30 ;PCR技术的应用;遗传性疾病;传染性疾病;法医学;植物遗传育种;畜 牧;植物保护;其他 ①考古学 ②植物分类学 ③群体生态学