染色质免疫沉淀ChIP实验指南及技术总结.docVIP

染色质免疫沉淀（ChIP）实验指南及技术总结 ChIP是一项比较流行的研究转录因子（ transcription factor, TF）与启动子（promoter）相互结合的实验技术。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。 一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。 在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量－PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q－PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP（其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。 第一天： （一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。 1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。（培养基共有9ml） 2、37摄氏度孵育10min。 3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。 450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。 4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。 5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min收集细胞。 6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。 假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。 将2管混在一起，共800ul。 7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。 （二）、除杂及抗体哺育。 8、超声破碎结束后，10，000g 4度离心10min。去除不溶物质。 留取300ul做实验，其余保存于－80度。 300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul 5M NaCl （NaCl终浓度为0.2M），65度处理4h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。 9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。 再各加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度颠转混匀1h。 10、1h后，在4度静置10min沉淀，700rpm离心1min。 11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul 抗体，另一管中则不加抗体。4度颠转过夜。 （三）、检验超声破碎的效果。 取100ul超声破碎后产物，加入4ul 5M NaCl，65度处理4h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。 第二天： （一）、免疫复合物的沉淀及清洗。 12、孵育过夜后，每管中加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。 4度颠转2h。 13、4度静置10min后，700rpm离心1min。除去上清。 14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4度颠转10min，4度静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。 洗涤溶液：a. low salt wash buffer—-one wash b. high salt wash buffer—–one wash c. LiCl wash buffer——one wash d. TE buffer——two wash 15、清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100ul 10％SDS， 100ul 1M NaHCO3， 800ul ddH2O，共1ml。 每管加入250ul洗