雌激素撤退对转染表达braf v600e的结肠上皮细胞生物学特征的影响word论文.docxVIP

雌激素撤退对转染表达BRAFV600E的结肠上皮细胞生物学特征的影响硕士：周豪导师：蔡开琳副教授摘要目的：观察雌激素水平改变对转染表达BRAFV600E的结肠上皮细胞凋亡、细胞周期、侵袭和克隆形成能力的影响，以探讨BRAFV600E突变的结肠上皮细胞在女性绝经前后的生物学改变。方法：以过表达 BRAFV600E质粒和对应空载体包装成慢病毒感染正常结肠上皮细胞 NCM460。嘌呤霉素筛选出阳性克隆(NCM-BRAFV600E 、NCM-Vector)。再以正常NCM460 细胞和感染了空载体质粒的NCM460细胞(NCM-Vector)作为对照，通过WB检测感染了含 BRAFV600E 质粒的 NCM-BARFV600E 细胞中 BRAF/MEK通路激活情况，已建立 NCM-BRAFV600E和NCM-Vector稳定表达细胞株。在有或无雌激素作用于NCM-BRAFV600E 和结肠癌细胞 RKO 的条件下，利用流式细胞术AnnexinV/PI染色和 WB 检测 Caspase-3、BAX、BCL2蛋白以检测NCM-BRAFV600E和RKO细胞的凋亡情况；采用 WB检测NCM-BRAFV600E和RKO细胞中细胞周期相关蛋白P27、cyclinD2的表达情况；采用WB检测NCM-BRAFV600E和RKO细胞中E-cadherin的表达情况;采用软琼脂克隆形成实验，检测NCM-BRAFV600E在琼脂介质中的克隆形成能力。结果：相对于无雌激素作用时，在有雌激素作用时，NCM-BRAFV600E 细胞中促凋亡相关蛋白Caspase-3、BAX表达升高，而凋亡抑制蛋白BCL-2表达降低，流式细胞术同样显示NCM-BRAFV600E 凋亡比例增加；NCM-BRAFV600E 细胞中细胞周期抑制蛋白 P27 表达升高，而细胞周期促进蛋白cyclinD2 表达降低；NCM-BRAFV600E 细胞中1E-cadherin表达增高；软琼脂介质中NCM-BRAFV600E生长受到抑制；有或无雌激素作用于RKO，WB检测凋亡相关蛋白Caspase-3、BAX、BCL-2；细胞周期相关蛋白 cyclinD2、P27；侵袭相关蛋白E-cadherin以及流式细胞术检测凋亡均无明显差异。结论：结肠上皮细胞（NCM460）发生BRAFV600E突变后雌激素仍对其有促进细胞凋亡，抑制细胞周期、侵袭的作用，雌激素撤退后转染表达BRAFV600E的结肠上皮细胞在软琼脂克隆形成实验中克隆形成能力明显增强，结果证实发生BRAF突变的结肠粘膜上皮的恶性转化过程受雌激素的抑制，绝经后其恶变过程可能加快。本研究提示绝经后妇女BRAF突变肿瘤发病率明显增加的原因与雌激素促进突变的结肠粘膜细胞凋亡、抑制克隆形成等有关。雌激素撤退对细胞凋亡过程的影响，是否会改变BRAF突变后结肠粘膜细胞后续恶性转化的病理表型，还有待下一步研究。关键词：雌激素BRAFV600E 细胞凋亡细胞周期侵袭克隆形成2Effectsofestrogenwithdrawal onthebiologicalcharacteristicsofthecolonicmucosacelltransfectedwithBRAFV600EDepartment ofGeneralSurgery,UnionHospitalofTongjiMedicalCollege, HuazhongUniversityofScienceand TechnologyMasterCandidate:ZhouHaoSupervisor:CaiKailinAbsractObjectiveObservedtheeffectsofestrogenwithdrawalonapoptosis,cellcycle andinvasion of thecolonicmucosacellstransfectedwithBRAFV600Etoexplorethebiological changesofcolonicmucosacellswithBRAFV600Emutationsbeforeandafter menopauseinwomen.MethodsOver-expressionplasmidofBRAFV600Eandemptyplasmidwerepackedinto lentivirus,whichwereusedtotransfecttheNCM460normalcolonepithelialcells. Thepositive coloncells(NCM-BRAFV600E/NCM-Vector)were selectedbypuromycin andconfirmedbywesternblot.Undertheconditi