大黄提取物对胰酶的抑制作用研究.docVIP

2.3大黄提取物对胰酶的抑制作用研究 2.3.1大黄提取物对胰脂肪酶的抑制作用 2.3.1.1试剂配制 三羟甲基甲烷缓冲溶液：称取三羟甲基甲烷606mg，加入45.7ml 0.1mol/L HCl溶液溶解，加蒸馏水定容至100ml，摇匀，调PH=7.1，4℃冰箱贮藏。 橄榄油乳液：吸取橄榄油4ml，称取阿拉伯胶7.5g，加蒸馏水100ml，用高速组织捣碎机以8000r/min，搅拌两次，每次三分钟，使90%乳粒的直径小于3um，不得大于10um，现配现用。 8%牛胆盐溶液，取8g牛胆盐，用温水溶解，定容至100ml。 0.1mol/L NaOH 溶液。 混合指示剂[64]：将1分0.1%百里酚兰50%酒精溶液与3份0.1%酚酞50%酒精溶液混合即得。 大黄提取液：将干燥、干净大黄粉碎，过20-30目筛，取100g投入圆底烧瓶中，加入氯仿和浓度为5%的硫酸的混合液，比例为7：3。固液比为1：8，密封浸泡过夜。次日，加热回流提取，水浴75℃，待瓶内提取液沸腾开始计时，提取2h，过滤；滤渣中继续加入上述提取液，固液比为1：5，加热回流提取2h，再重复一次。合并三次提取液，抽滤，减压浓缩。按体积比1:1用氯仿进行萃取，萃取三次，回收氯仿层。减压干燥，挥干氯仿，得到大黄粗体物。 加入适量蒸馏水，超声处理30min，定容至100ml。 2.3.1.2供试品溶液的制备 参照《中华人民共和国药典》胰蛋白酶的检验方法，精密称定0.1g胰蛋白酶放置于乳钵中，加冷至5℃以下的三羟甲基甲烷缓冲液少量，研磨均匀，转移至50ml容量瓶中，加上述缓冲液至刻度，摇匀。 2.3.1.3大黄提取物对胰脂肪酶的抑制作用 2.3.1.3.1原胰脂肪酶活力的测定 按照药典方法，取橄榄油乳液25ml，8%牛胆盐溶液2ml与蒸馏水10ml，置于100ml烧杯中，置磁力恒温搅拌器上预热10min，加入混合指示剂8滴，用0.1mol/L NaOH 溶液滴定液调节PH=9.1，显示灰红色。精密量取样品溶液1ml，在37℃+0.1℃水浴中准确反应10min，反应过程中不断滴加NaOH 溶液，使反应液的PH恒定在9.1，烧杯中一直保持灰红色，记录消耗NaOH 滴定液的量。 另取在水浴中沸煮15min的已灭活的酶样品溶液1ml，按照上述方法测定，做空白对照，按下列公式计算： （A-B）M×1000 n 每1g含胰脂肪酶活力单位= × 10 W 其中：A为样品消耗氢氧化钠滴定液的容积，ml； B为空白消耗氢氧化钠滴定液的容积，ml； M为氢氧化钠滴定液的浓度，mol/L； W为样品取样量，g； n为样品稀释倍数（50） 2.3.1.3.2大黄提取物抑制胰脂肪酶活力的测定 取橄榄油乳液25ml，8%牛胆盐溶液2ml与蒸馏水10ml，加入1ml大黄提取液，置于100ml烧杯中，方法同2.3.1.3.1，记录消耗NaOH 滴定液的量。空白对照实验也同样加入1ml大黄提取液，方法同2.3.1.3.1，记录数据，计算结果。A’为加入大黄提取液样品消耗氢氧化钠滴定液的容积；B’为空白消耗氢氧化钠滴定液的容积。 2.3.2大黄提取物对胰蛋白酶的抑制作用 2.3.2.1实验原理 在蛋白酶的作用下，蛋白质水解可得到一系列中间产物，最终生成α-氨基酸，将蛋白质加入含有蛋白酶的溶液里分解一段时间，通过测定生成的α-氨基酸的含量，可以反映蛋白酶的活性。茚三酮比色法是常用的测定氨基酸含量的办法。在微酸环境下，茚三酮与氨基酸发生氧化还原反应，氨基酸被氧化成氨、二氧化碳和醛，茚三酮则被还原；还原型茚三酮、氨和另一分子茚三酮进行进一步反应生成二酮茚一二酮胺的取代盐，呈蓝紫色，其最大吸收光波长为570nm，颜色深度与氨基酸的含量成正相关。 2.3.2.2试剂配制 茚三酮—乙醇—抗坏血酸混合试剂：称取2g茚三酮，0.02g抗坏血酸，溶于100ml无水乙醇。 0.2%KIO3溶液。 0.01% 甘氨酸标准溶液：称取1g甘氨酸溶于水中，定容至100ml，再精确吸取1ml，稀释至100ml。 PH 5.8乙酸—乙酸钠缓冲溶液：94ml 0.2mol/L乙酸钠与6ml 0.2mol/L乙酸混合。 CaCl2溶液：称取1.47g CaCl2溶解于蒸馏水500ml，用0.1mlHCl溶液调PH=6.0-6.2。 酪蛋白溶液：称取酪蛋白对照品1.5g，加13 ml 0.1mol/LNaOH溶液和40ml蒸馏水，水浴60℃溶解，放置冷却，加水定容至100ml，用0.1mol/LNaOH