炎症动物免疫重复试验方案.docVIP

2010/11/15: 炎症动物免疫试验方案 （天津科技大学 食品与生物技术实验室） 一 目的 从类黄酮和异黄酮针对黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase)和环氧合酶-2(cyclooxygenase-2)双酶抑制剂通过计算机虚拟筛选出的九种天然产物在小鼠体内中免疫保护效果的研究，为制定炎症通风的临床研究方案和药物提供实验依据。 二 材料 ㈠ 从类黄酮和异黄酮筛选出的九种天然产物： Luteolin, Apigenin, Scutellarein, Quercetin, Myricetin, Genistein, Isoquercitrin, Rutin, Hyperoside. XO及COX-2是痛风治疗过程中的两个重要靶点，筛选XO和COX-2双重抑制剂可以从多靶点的途径有效的控制炎症相关疾病如痛风的发生和发展。另外，XO以及COX-2也是各种癌症及其他重要疾病的重要靶点，本试验室已从天然产物采用计算机辅助筛选XO及COX-2的双重抑制剂，得到的天然产物黄酮为九种：Luteolin, Apigenin, Scutellarein, Quercetin, Myricetin, Genistein, Isoquercitrin, Rutin, Hyperoside. 由于淋巴细胞是人体最主要的免疫细胞，由该细胞介导的这种炎症反应在各种风湿、痛风等疾病，尤其是类痛风炎症病理过程中起着主导作用，这类免疫性炎症模型对研究抗炎抗痛风药物具有重要价值。因此在细胞水平上建立T淋巴细胞模型--这类免疫性炎症模型对研究抗炎抗痛风药物具有重要价值。 ㈡ 动物： 1．小鼠品系及特点 BALB/C小鼠，雄性，15只体重(20±2)g 。 该品系为白化小鼠,对致癌因子敏感;自发高血压症;一般无互相侵袭匀性,较容易群养,对放射线极度敏感等品系特征,故已越来越广泛地被用于肿瘤、生翟、免疫等方面的研究和单克隆抗体制作等新技术。 2．饲养条件（包括动物房及饲料等） 饲养条件：清洁级动物房，温度21－23℃，相对湿度44－65％。自由饮水，饮食。 ㈢ 试剂： 1．COX-2、RPMI1640培养基（GIBCO BRL）；胎牛血清（Fetal Calf Serum）（兰州民海生物工程有限公司）；Concanavalin A（Con A）、IL-1（美国Sigma），台盼蓝（TryDan blue）（美国Sigma）；Cycloheximide（CHX），MTT，DMSO （Dimethyl Sulphoxide），T淋巴细胞分离液(China,Dakewe)， DMSO。药品：XO, xanthine, allopurinol, myricetin, and isoquercitin (Sigma); Apigenin, quercetin, luteolin, scutellarein, and rutin (Nanjing Tcm Institute of Chinese Materia Medica); Hyperoside (National Institute.) 2. 流式分析： FITC anti-mouse CD-4; PE anti-mouse COX-2 3. 仪器：二氧化碳细胞培养箱，灭菌锅，制冰机，倒置显微镜，Nikon出品；Spectrum MAXl90酶标仪（美国MD公司），细胞培养板（美国COSTAR公司），微量加样器（10mL，200mL和l000pL）（德国Eppendoff），无菌实验台；台式离心机；电子天平，Millex微孔滤膜（0.22μm）（爱尔兰Carrighwohill公司）。 4. 耗材：解剖剪，镊子，15/50ml离心管，移液器，加样槽，Tip头，1/10ml吸管。 5筛选产物对急性痛风炎小鼠前列腺组织中环氧化酶-2(COX-2) mRNA表达的影响： RNA 提取试剂盒，引物）为：? 三 设计思路与实验设计 ㈠ 设计思路： 通过使用虚拟筛选出来的天然产物，重点研究：（1）细胞水平反映的是药物对细胞的整体作用。（2）动物水平反映的天然产物使用时间后的免疫保护效果差异。 ㈡ 实验设计： 分子水平： 方法：使用试剂盒COX Fluorescent inhibitor screening assay kit (cayman.) 本实验室已做。 细胞水平 2.1试剂: RPMI1640培养基; FBS; 双抗； MTT溶液的配制：MTT溶于PBS(0．01 mol·r，pH7。4)配成5mg／mL贮备液，溶解后用0．22pm的微孔滤膜除菌。4℃避光保存。两周有效。 刺激剂：Concanaval in A （Con A）/IL-1； 台盼蓝储液配制：称取4．Og台盼蓝