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蛋白质含量测定 2004-0-11 介绍 蛋白质含量测定方法 Lowry法（酚试剂法） 考马斯亮兰G-250染色法 双缩脲法 微量凯氏定氮法 紫外光谱215和225吸收差法 紫外光谱280和260吸收差法 紫外光谱280吸收法 Lowry法 标准曲线的绘制 方法与材料 结果 TNF-a 生物学活性检测 基本原理 TNF的生物学活性之一是能够直接杀伤肿瘤细胞。TNF的杀伤活性主要由TNFR1和TNFR2介导。用放线菌素D、丝裂霉素C、放线菌酮等处理细胞，可以明显增强TNF-a杀伤肿瘤细胞活性。 实验方法 标准品稀释 样品稀释 细胞培养 结晶紫染色 绘制标准曲线和样品活性曲线，计算样品活性 * * 280nm 0.1-1 蛋白质中的W和Y残基的苯环中含共轭双键，在280nm有最大吸收 280吸收法 mg/ml=1.45A280-0.74A260 0.1-1 核酸260nm的吸收比280nm强，而蛋白质正相反， 280260吸收差法 mg/ml=0.144(A215-A225) 0.02-0.1 蛋白质的肽键在200-250nm有强的紫外吸收，且波长越短光吸收越强。若选用215nm可减少干扰及光散射。用215nm 和225nm 光吸收差值可减少非蛋白质成分引起的误差。 215225吸收差法 54Onm 1-10 在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形成复杂的紫红色复合物。蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似，也能与铜离子在碱性环境中形成紫红色复合物。 双缩脲法 0.2-2 有机物与浓硫酸共热,有机氮转变为无机氮氨,氨与硫酸作用成硫酸铵,后者与强碱作用释放出氨.借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此过量酸液被中和的程度即可计算出样品的含氮量,再推知蛋白含量 凯氏定氮法 595nm 0.01-1 蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化从而改变这些染料的光吸收.考马斯亮蓝G-250 在酸性溶液中为棕红色当它与蛋白质通过范德华键结合后变为蓝色 G-250染色法 650nm 0.025-0.25 碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质铜复合物该复合物随之将磷钼酸磷钨酸还原成蓝色复合物 Lowry法 备注 灵敏度(mg/ml) 原理 方法 0.1545 0.143 0.127 0.118 0.105 0.092 OD650nm 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蛋白浓度