第八章酶制剂演示课件.ppt

6.萃取分离 萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。有时也可采用其它流体。 按照两相的组成不同，萃取可以分为： 有机溶剂萃取 双水相萃取 超临界萃取 反胶束萃取 五、酶的浓缩、干燥与结晶 浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）分离的过程。在酶的分离纯化过程中是一个重要的环节。 离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分，也可以达到浓缩效果。 蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。由于酶在高温条件下不稳定，容易变性失活，故酶液的浓缩通常采用真空浓缩。即在一定的真空条件下，使酶液在60℃以下进行浓缩。 在固体酶制剂的生产过程中，为了提高酶的稳定性，便于保存、运输和使用，一般都必须进行干燥。常用的干燥方法有： 真空干燥 冷冻干燥 喷雾干燥 气流干燥 吸附干燥 结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。酶的结晶是酶分离纯化的一种手段。它不仅为酶的结构与功能等的研究提供了适宜的样品，而且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。 酶在结晶之前，酶液必须经过纯化达到一定的纯度。如果酶液纯度太低，不能进行结晶。通常酶的纯度应当在50%以上，方能进行结晶。总的趋势是酶的纯度越高，越容易进行结晶。 要说明的是，不同的酶对结晶时的纯度要求不同。 有些酶在纯度达到50%时就可能结晶，而有些酶在纯度很高的条件下也无法析出结晶。所以酶的结晶并非达到绝对纯化，只是达到相当的纯度而已。 盐析结晶 有机溶剂结晶 透析平衡结晶 等电点结晶 第四节 酶的固定化 固定化酶(Immobilized Enzyme）是20世纪60年代发展起来的—项新技术。以往使用的酶绝大多数是水溶性的酶。这些水溶性酶催化结束后，极难回收，因而阻碍了酶工业的进一步发展。60年代后，在酶学研究领域内涌现出固定化酶。它是通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶柬缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用；过去曾称其为水不溶酶或固相酶。1971年第一届国际酶工程会上正式建议采用固定化酶的名称。 从60年代起，固定化酶的研究发展很快，起初人们把注意力集中在酶的固定化方法研究上，近年来，不但固定化方法和载体开发有了长足发展，并且已转向它在工业、医药、化学分析、亲和层析、环境保护、能源开发以及理论研究等方面的应用研究。 一、酶的固定方法 （一）固定化酶的优缺点 固定化酶的研究已取得大量重要成果．发挥着巨大作用，受到人们极大的关注。其重要原因是它和水溶性酶比较具有以下优点： (1)极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺. (2)可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化。 (3)酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化。 (4)在绝大多数情况下提高了酶的稳定性。 (5)较能适应于多酶反应。 (6)酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低。 固定化酶也存在一些缺点： (1)酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化的成本，使工厂开始投资大。 (2)比较适应水溶性底物和小分子底物。 (3)与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应，同时对胞内酶需经分离后．才能固定化。 （二）酶的固定化方法 酶的固定化方法有：吸附法；共价键结合法；交联法；包埋法. 如下图: 1. 吸附法 吸附法分为物理吸附法和离子交换吸附法。 (1) 物理吸附法: 通过氢键、疏水作用和π电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上．从而制成固定化酶。常用的载体有： ①有机载体。纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等。比如用纤维索作为吸附剂，用膨润的玻璃纸或胶棉膜吸附木瓜蛋白酶、碱性磷酸脂酶、6—磷酸葡萄糖脱氢酶。吸 附后在载体表面形成单分子层，吸附蛋白能力约70mg/cm2。 ②无机载体。氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等。比如用多孔硅为载体吸附米曲酶和枯草杆菌的α-淀粉酶以及黑曲霉的糖化酶，在45℃进行固定化，用高浓度的底物进行连续反应。半衰期分别为14、35、60d。无机载体的吸附容量较低、而且酶容易脱落。 (2)离子交换吸附法: 这是将酶与含有离予交换基的水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。酶吸附较牢，在工业上颇具广泛的用途。常用的载体有阴离子交换剂，如二乙基氨基乙基(DEAE)-纤维素、混合胺类（ECTEDLA）—纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)—纤维素、DEAE—葡聚糖凝胶、Amberlite IRA—93、410、900等。 阳离子交换剂，如羧甲基(C