细胞工程___第四章原生质体与细胞融合用.pptVIP

三、原生质体的培养 （一）原生质体的分离方法(P76) 1.机械法 特点:手工操作难度大，原生质体得率非常低，而且费时费工，难以进行原生质体大量制备。 2.酶解法 酶:琼脂酶、果胶酶、蜗牛酶、纤维素酶等，实际应用中需要根据不同的细胞来源选择合适的酶。 特点:条件温和、原生质体完整性好、活力高、得率高等优点。 (二）原生质体纯化方法(P76) 1.过滤离心法 多采40-100um的网筛过滤,收集网上细胞，在适当溶剂内低速离心收集沉淀，如此反复3-4次，可得到原生质体。 2.漂浮法 原生质体比重较小，能在具有一定渗透压的溶液(如25%的蔗糖溶液)中漂浮，燃后用吸管收集。此优点：原生质体比较纯净，缺点：丢失的较多。 2酶处理 1)酶的种类和作用 （1）果胶酶类：从根霉和黑曲霉中提取的，其作用能降解中胶层，使细胞从组织中分离出来。 常用的商品酶： Pectolyase Y-23 Japan ；Mecerozyme R-10 Japan Mecerozyme JapanPectinase Sigma；Pectinal USA。 五.原生质体鉴定 1)低渗爆破法：无壁吸水向外膨胀直至胀破，是无形的。有部分细胞壁，则原生质体从破碎后留下的残迹仍保持半圆形的细胞壁。 2)荧光染色法:将原生质体放大离心管中，加入0·7mo l/L甘露醇配置的0.05%~0.1%荧光增白剂溶液，染色5-10Min ，离心、洗涤除去多余的染料，在荧光显微镜下观察(波长3600-4400A0)。绿色光显示纤维素的存在，发出红色光的没有纤维素的真正的原生质体。 六.原生质体活力测定 (1)染色法: 1)二乙酸荧光素(FDA)法:FDA本来没有荧光，当其进入细胞后被脂酶分解具有荧光的极性物，不能透过质膜，而是留在细胞内发出荧光。因此能发出荧光的是具有活性的原生质体，不发荧光的为死亡的原生质体。 2)酚藏花红染料法:具有活力的原生质体吸收染料(浓度为0.01%)显红色;活力的不能吸收染料而显示白色。 3)伊文思蓝染色法:有活力的细胞不吸收染料(浓度为0.25%)为无色，而没有活力的吸收染料显示蓝色。 (2)胞质环流法:在显微镜下观察原生质体是否存在胞质环流来判断原生质体的活力。有胞质环流的是有活力的。 (3)渗透压变化:将原生质体放人较低渗透压的溶液中，体积会膨胀;放入高渗透压的溶液中，体积会缩小，这样的原生质体是有活力的原生质体，而体积不变的是己经死亡的原生质体。 (4)氧电极法:有活力的原生质体在光照下会进行光合作用而放出氧气，在没有光照的条件下进行呼吸而耗氧。因此，可以采用氧电极来测定氧的变化来原生质体是否具有活力。 注意事项 1）对介质要求高，一般用高纯度的蒸馏水并选用适当的非电介质溶液，如甘露醇等配制等渗性介质。 2）注意控制高频交流电压和直流脉冲电压的强度和时间，以防止细胞连接成串或发生可逆性降解。(50mA1.2-2kV/cm) 优点： 融合率高，达70％－80％，甚至100％ 融合率＝（融合组多核细胞的核数－对照组多核细胞的核数/对照组的全部细胞数）×100％ 可在显微镜下定向诱导细胞融合 可直接挑选杂种细胞 利用细胞融合技术得到的重组细胞 1、2、3亲本细胞 4、6核体 5、7胞质体 8、9杂种细胞 10重组细胞 11胞质杂种细胞 ⅠPEG介导 ⅡHAT培养基筛选 植物细胞筛选方式 1）遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种细胞表现正常。 如亲本1：叶绿体缺陷型 亲本2：光致死型 两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白 色，融合细胞长成植株呈绿色，并能成长。 2）抗性互补筛选法：利用亲本细胞原生质体对抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞。 如： 亲本1：对放线菌素D抗性，但在MS培养基上不能超过50个世代 亲本2：对放线菌素D很敏感，但能在MS上生长 杂种细胞能在含有放线菌素的MS培养基上生长，而亲本和其它细胞死亡 3）利用物理特性筛选法：根据亲本的原生质体大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞。 亲本1：用异硫氰酸荧光素染色原生质体 亲本2：叶肉细胞原生质体 在荧光显微镜下，亲本1为红色，亲本2为绿色，杂种细胞可以区分 4）利用生长特性筛选法：利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。 例如粉兰烟草与朗氏烟草细胞原生质体均需外源激素才能生长，但其融合细胞可以产生内源激素，在培养基上不需加激素。 动物细胞的筛选方式： 1）利用抗药性筛选系统：利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。 亲本