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（3）PCR引物设计 中山大学药学院 PCR引物的设计原则 1 PCR的引物设计 PCR引物的使用 引物的在线设计工具及免费软件简介 中山大学药学院 PCR引物的设计原则 选择合适的引物是PCR实验设计的重要步骤，合适引物最基本的 引物的长度 标准就是与靶序列的高特异性杂交。为达到此目的，引物设计应注意 下列几点： 理想的引物长度应该在18-30个碱基之间，常见的是20-27个碱基 PCR引物的设计原则 引物的GC含量 引物序列中的GC含量应在35% - 65%之间，最好在45% - 55%范 围内。如果因靶序列的原因，引物不得不含有过高的GC碱基，那么就 在其5’端设计一串A或T；同样，如果引物中的AT含量过高，就在其 5’ 端设计一串G或C，以便将整条引物的GC含量控制在合适的范围内。 PCR引物的设计原则 退火温度（Ta） 引物的退火温度一般要比估计的相应熔点温度低5℃左右，在很多 情况下，两条引物的退火温度不尽相同，只要两者相差不到4-6℃，尚 不至于影响RCR扩增反应的产量，但它们的退火温度应在55-75℃范围 引物碱基≤20，Ta = 4 X（G+C）+ 2 X（A+T）- 5（℃） 内。如果两条引物的退火温度差别过大，可以适当延长较低Ta值的引 物的3’端（这样可以保持扩增产物的长度不变）或5’端。 引物的T