10 原位杂交组化和免疫组化PPT.pptVIP

I. 简介 A. 原理: 应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针(Probe)与组织中待检核酸按碱基配对的原则进行特异性结合以形成杂交体, 再显示标记物于LM或EM下观察. B. 分类: 可分为DNA-DNA杂交, DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交. 第十章. 原位杂交组化和免疫组化 (In situ hybridization Histochemistry Immunohistochemistry) C. 标记物: 分为放射性和非放射性标记物. D. 检测方法: 1. 直接法: 探针用荧光等标记物直接标记, 杂交后直接显示. 2. 间接法: 探针用半抗原或生物素等标记, 杂交后再用组化或免疫组化法显示标记物. II. 探针: 对靶核苷酸应具有高度特异性, 组织穿透力强, 标记物易检出以及制备简单等特点, 与对免疫组化中一抗的要求相似. A. 探针的制备: 大量制备可使用PCR技术. 1. 核酸的获取和制备: a. DNA: 一般为双链重组DNA(cDNA). *. 用限制性内切酶获取待测基因或其一部分. *. 用DNA连接酶把该片段整合入载体(如细菌质粒pBR322)形成重组质粒, 并引入细菌体内转化和克隆. *. 用同一内切酶切下插入的DNA序列, 纯化后即得到大量的非标记探针. b. cRNA: *. 将目的基因序列添加到SP6和T7表达载体的SP6启动子和T7启动子之间的多克隆位点中, 克隆. *. 用限制性内切酶在插入序列的下游将质粒线性化. *. 用SP6和 T7 RNA聚合酶分别启动其下游序列的转录. 在4种NTP(其中1种被标记)的存在下, 可得到一对RNA探针(DNA模板可用无RNA酶污染的DNA酶清除). *. 其中一条RNA的序列与目标mRNA序列互补, 称之为反义RNA探针即cRNA探针, 另一条为正义RNA探针, 可做为cRNA探计的阴性对照. cRNA-RNA杂交体不受RNA酶影响, 杂交后可用RNA酶处理切片除去可能的非特异杂交. c. 寡核苷酸: 根据已知基因的核苷酸序列用DNA合成仪人工合成. III. 基本步骤 A. 基本流程: 方法因组织, 目标核酸及探针种类不同而各异, 但基本流程大致相同. B. DNA探针检测石蜡切片中mRNA: 1. 组织制备: a. 基本原则: *. 保存完好的细胞形态结构, DNA和RNA. *. 检测mRNA时烧烤或用0.1%焦碳酸二乙酯(Diethypyrocarbonate, DEPC, RNA酶抑制剂)处理所有器具. b. 步骤: 固定, 包埋, 切片, 粘附于多聚赖氨酸处理的或硅化的洁净载玻片上. 硅化: 2% 氨丙基三乙氧基硅烷(Aminopropyltriethoxysilane, APTES)丙酮液浸泡3分钟, 用丙酮洗去APTES, 用0.1%DEPC DDH2O清洗玻片1~2次. 2. 预处理目的和原理: a. 0.2M HCl, 1?g/ml蛋白酶K和Triton X100等可增加组织结构对探针分子的通透性. b. 0.25%醋酸酐(Acetic anhydride)可促进碱基乙酰化, 中和电荷, 减少非特异结合. c. 检测DNA时, 先用100?g/ml RNA酶A和10U/ml RNA酶T1消化. 3. 预杂交, 杂交和杂交后处理(以同位素标记的探针为例): a. 预杂交目的: 用蛋白, 核酸和多糖等饱和非特异位点. b. 预杂交液和杂交液化学成分: 组成 最终浓度 作用 磷酸缓冲液 0.3M 离子浓度 葡聚糖硫酸酯(Dentran sulfate) 10% 促进杂交 Denhardt’s 0.2% 提高信噪比 焦磷酸钠(Sodium pyrophosphate, Na4P2O7) 0.05% 同上 鱼精DNA 0.05% 同上 EDTA