2-1 免疫组织化学技术PPT.ppt

第四章、免疫组织化学技术;概念：应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些多肽和蛋白质等大分子物质进行原位定性、定位或定量研究的技术称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术。 基本过程：被检抗原/半抗原提取→免疫动物→特异性抗体→标记抗体→抗原抗体反应部位出现有色沉淀;免疫酶组织化学 免疫荧光组织化学 免疫胶体金组织化学 亲和免疫组织化学 （抗原信号放大系统） 优点：特异性强，敏感度高，应用广泛。;第一节 免疫组织化学基本原理;优点：简单快速，特异性强，非特异性反应低； 缺点：敏感性差；抗原量要求高；很难获得各种市售标记抗体。（肿瘤蛋白标记物：低丰度蛋白） ;优点：间接法因第二抗体的放大作用敏感性大大增高（放大原理=抗原：抗体1：6）； 缺点：可能出现非特异性反应； ;三、亲和免疫组织化学;亲和素 (avidin)又称抗生物素蛋白，是一种糖蛋白。天然(卵白)亲合素为碱性蛋白，分子量为6.8KD，pI 10～10.5；在pH9～13缓冲液中性质均稳定。由4个相同的亚单位构成4聚体；每个亲合素亚单位通过其结构中的色氨酸残基与生物素中的Ureido环（I环）结合。因此，1个亲合素分子存在4个与生物素分子结合位点; ABC法;;2. 免疫组织化学酶类标记物;用于标记的酶的特性 酶催化反应形成的产物易于在光镜下观察 酶反应终产物是稳定的沉淀，不会从酶活性部位向四周弥散而影响组织学定位 较易获得纯的酶分子 中性PH值时，酶分子稳定 酶连接在抗体上，二者活性均不受影响;HRP底物: 过氧化物：过氧化氢 供氢体：二氨基联苯胺 (Diaminobenzidine,DAB) 3-氨基-9乙基咔唑 (3-amino-9- ethylcarbozole, AEC) DAB + H2O2 棕色； AEC + H2O2 紫红色 AP磷酸酯水解酶， 溴氯羟吲哚磷酸盐(底物）/硝基蓝四唑 (BCIP/NBT) 溴氯羟吲哚磷酸盐(底物）/硝基四紫唑 (BCIP/INT) NBT/BCIP 蓝紫色 INT/BCIP 棕红色或橘黄色 ;ABC法的优点：敏感性更高 ABC法的缺点： ①亲和素(鸡蛋白)中含有10%糖类，导致背景着色 ②亲和素的等电点约10左右，带较多的负电荷，导致纤维组织着色。 ③内源性生物素导致背景着色 ④亲和素中有4个结合点，其中一半与连接抗体结合，另一半与复合物结合，可降低其敏感性 。; (二)链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶法 （Streptavidin-peroxidase method，SP法）;Ag;链霉亲和素SA（链霉菌抗生物素蛋白）约6.5KD，由4条相同肽链构成，每条肽链可结合1个生物素分子。每个SA有4个生物素结合位点，结合常数与A相同为1015mol/L，约为抗原抗体间ka（105～1011 mol/L)的1万倍以上。 SA最高的活性可达18u，较A高（15u）；SA的四个亚基可以全部和二抗上的生物素结合。 链霉亲和素组织穿透性强，反应速度快。 等电点为5.5~6.7，接近中性，所带的负电荷少； 链霉亲和素不含糖基。 敏感性更高，特异性更强。;第二节、免疫组织化学染色步骤;2.脱腊和水化：二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡15min脱蜡→100﹪酒精Ⅰ、Ⅱ中分别浸泡5min→95﹪、90﹪、80﹪、70﹪酒精各浸泡2min→PBS洗3次×3min,置蒸馏水中待用；;3.抗原修复：甲醛形成醛键、羧甲基等封闭部分抗原决定簇；蛋白分子交联隐蔽了抗原决定簇。 加热修复 ： ①高压修复：pH 6.0的0.1mol／L柠檬酸缓冲液高压锅内煮沸，切片置于其中,高压修复1.5min，室温冷却，蒸馏水和PBS各冲洗2次×3min； 注意：时间过长背景加深；新鲜柠檬酸缓冲液；缓冲液足量;②微波修复：pH 6.0的0.1mol／L柠檬酸缓冲液微波煮沸，切片置于其中，中高档微波处理15-20min，室温冷却，蒸馏水和PBS各冲洗2次×3min； ;③蒸汽修复: 内，盛自来水的铝制容器加热至水沸腾,放入含pH 6.0的0.1mol／L柠檬酸缓冲液和切片的容器.继续沸腾10-15min,室温冷却. (强烈推荐);胰蛋白