9 第9章 酶免疫技术PPT.pptVIP

第三节　酶联免疫吸附试验 　 底物显色 定性或定量的分析 原理 包被 反应 加入待测抗体或 抗原和酶标抗原 或抗体 洗涤 使结合在固相上 的抗原抗体复合物 与未结合的分离 1 2 3 4 一、基本原理 固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物） 酶反应的底物 三个必要试剂 二、方法类型及反应原理 双抗体夹心法（非竞争结合） 检测含有至少两个抗原决定簇的多价抗原。 利用连接固相载体上的抗体和酶标抗体可分别与样品中被检测抗原分子上两个不同抗原决定簇结合，形成固相抗体－抗原－酶标抗体免疫复合物。 ELISA检测抗原的方法 双抗体夹心法 方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色 应用： 二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等 ELISA检测抗原的方法 双抗体夹心法测抗原 + - E E E E E E E E E 竞争法 方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等） ELISA检测抗原的方法 . 竞争法测抗原 + - E E E E E E E 2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合 3、加酶作用 的底物不显色 或显色弱 3、加酶作用 的底物显色 1、已知抗体包 被于载体表面 1、已知抗体包 被于载体表面 2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合 E 间接法 方法 用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。 优点 一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体 应用 常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定 ELISA检测抗体的方法 间接法测抗体 - E E E E E E E E E + 双抗原夹心法 原理：类似双抗体夹心法 操作步骤：类似 应用：乙型肝炎表面抗体 ELISA检测抗体的方法 竞争法 原理：类似检测抗原的竞争法 应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测 ELISA检测抗体的方法 HBcAb竞争法： 核心抗原包被在固相载体上形成固相抗原，加入待测标本和酶标记的特异性核心抗体 此时待测标本中的HBcAb与酶标记HBcAb竞争与核心抗原结合 显色的强弱与待测标本中的HBcAb含量成反比。 ELISA检测抗体的方法 HBeAb竞争法： 先将HBeAb包被在固相载体上形成固相抗体，加入待测标本和中和抗原HBeAb 此时待测标本中的HBeAb和固相抗原竞争结合中和抗原HBeAb，待测标本中HBeAb浓度越高，与固相抗体结合的越少 显色的强弱与待测标本中的HBeAb含量成反比。 ELISA检测抗体的方法 捕获法 应用： 病原体急性感染诊断中的IgM型抗体 甲型肝炎HAV-IgM抗体 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体 ELISA检测抗体的方法 捕获法 原理： 抗人IgMμ链抗体包被 捕获待测标本中IgM类抗体 加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体 底物显色 捕获法原理 + - E E E E E 1、固相化抗人 　IgM 1、固相化抗人 　IgM 2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合 3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合 4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色 2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合 3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合 4、加酶标抗体 无抗原结合， 加底物不显色 第四节 酶免疫测定的应用 均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。非均相免疫测定中的ELISA应用更为广泛，ELISA广泛用于传染病的诊断，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗体、“乙肝三对”、丙肝抗体、丁肝抗体、戊肝抗体）、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如结核杆菌、幽门螺杆菌等。也用于一些蛋白质检测，如各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）。 乙肝病毒表面抗原 采用单克隆抗－HBs包被反应板，加入 待测标本，同时加入多克隆抗－HBs－ HRP，当标本中存在HBsAg时，该 HBsAg与包被抗－HBs结合形成复合 物，加入TMB底物产生显色反应。 1、从冷藏室取出试剂盒，室温放30分钟，将浓缩洗涤液1：20稀释 2、加入待测标本0、05毫升，并设阴阳性对照和空白孔。 3、加酶结合物每孔0、05毫升，空白对照孔不加，37℃孵育30分钟。 4、洗板 5、加显色剂，先加显色剂A，再加显色剂B，混匀