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茶树DNA的快速抽提法 　　摘要：使用简化改良的ＣＴＡＢ法抽提茶树鲜叶ＤＮＡ，通过电泳和ＰＣＲ检测所提取ＤＮＡ的质量。实验结果表明，改良的ＣＴＡＢ法提取茶树ＤＮＡ，步骤减少、抽提过程简单、时间短、效率高，用嫩叶和成熟叶均能抽提出高质量的ＤＮＡ。 　　关键词：茶树；ＤＮＡ快速抽提；ＣＴＡＢ法；鲜叶保存 　　中图分类号：Ｓ５７１．１；Ｑ５２３ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８11423－4962-03 　　 　　Ａ Ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｔｅａ 　　 　　ＣＨＥＮ Ｚｈｉ－ｈｕｉ，ＺＨＯＮＧ Ｑｉｕ－ｓｈｅｎｇ，ＬＩＮ Ｚｈｅｎｇ－ｈｅ，ＹＯＵ Ｘｉａｏ－ｍｅｉ，ＣＨＥＮ Ｃｈａｎｇ－ｓｏｎｇ 　　 　　 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｍｅｌｉｏｒａｔｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｔｅａ ｌｅａｖｅｓ， ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ ＰＣＲ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｆ ｂｒａｎｃｈｅｓ ｉｎ ｗａｔｅｒ ｈａｄ ｎｏ ｏｂｖｉｏｕｓ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ． Ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｆａｓｔ ａｓ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｆｒｏｍ ｔｅｎｄｅｒ ｌｅａｖｅｓ ｂｕｔ ａｌｓｏ ｆｒｏｍ ｍａｔｕｒｅ ａｎｄ ｏｌｄ ｌｅａｖｅｓ． 　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｔｅａ； ＤＮＡ ｒａｐｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； ＣＴＡＢ method； ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｅｓｈ ｌｅａｖｅｓ 　　茶树ＤＮＡ抽提技术是茶树分子生物学研究的基础［１－３］，茶树富含多酚和多糖等多种次生代谢物质，使得提取高质量的ＤＮＡ较为困难。目前茶树ＤＮＡ抽提基本参考其他植物的抽提方法，主要有ＳＤＳ法［４，５］、ＣＴＡＢ法［６－9］等，这些方法对样品保存条件要求较为苛刻，常见的保存条件有冰块、超低温、液氮或硅胶脱水干燥等，叶片研磨要求放在冰上或者用液氮研磨，抽提步骤复杂，使用试剂多，抽提时间长［７－１2］。此外，在野外采样时使用冰块、液氮或超低温保存样品不太现实，增加了后续ＤＮＡ提取的难度。本实验采用枝梢保鲜法保存样品，同时简化和改良ＣＴＡＢ法抽提ＤＮＡ的步骤，抽提过程简单，时间缩短，并能获得高质量的ＤＮＡ，可有效解决样品运输保存和抽提中遇到的问题。 　　１ 材料与方法 　　１．１ 材料及保存方法 　　国家级茶树品种丹桂和铁观音采自福建省农业科学院茶叶研究所２号山茶园，春茶采摘后修剪长出的1芽５叶新梢。取样时每个样品保存1根枝梢，直接在枝条或叶片上用油性记号笔编号，捆绑成束，在枝条剪口处用湿纸或湿棉花包裹保湿，再装于合适大小的容器中，容器上扎些小孔通气，样品带回实验室后解开捆绑的枝梢插入水中，长期保存最好每２～３ ｄ换一次清水，枝梢保存２个月仍然鲜活。分别以不同品种的嫩叶、不同叶位的鲜叶以及在水中保存不同时间的枝梢上的叶片为材料，提取茶树基因组ＤＮＡ。 　　１．２ ＣＴＡＢ法抽提茶树基因组ＤＮＡ 　　从枝梢上剪取少量茶树鲜叶，加０．８ ｍＬ １．５×ＣＴＡＢ［１５ ｇ／Ｌ ＣＴＡＢ＋７５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ＋１５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ＋６１．４ ｇ／Ｌ ＮａＣｌ］研磨成糊状，装入１．５ ｍＬ离心管中；放入６５ 水浴锅中保温１５ ｍｉｎ；加入等体积的氯仿／异戊醇，放在摇床上轻摇１０ ｍｉｎ，再于１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ；吸上清液到另一个新离心管中，加入２倍上清液体积的９５％乙醇，上下颠倒数次混匀后放入－２０ 冰箱沉淀ＤＮＡ １５ ｍｉｎ；１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清液；所得ＤＮＡ沉淀吹干后加３００ μＬ ｄｄＨ２Ｏ溶解，重复步骤～，以去除杂质，提高ＤＮＡ提取质量；加１ ｍＬ ７０％乙醇上下颠倒数次，离心后倒出乙醇，吹干离心管，加入１００ μＬ ＴＥ或ｄｄＨ２Ｏ溶解，－２０ 冰箱保存备用。 　　１．３ 基因组ＤＮＡ电泳检测 　　１％琼脂糖凝胶电泳检测提取的茶树基因组ＤＮＡ，１８０ Ｖ电泳３０ ｍｉｎ后ＥＢ染色，在凝胶成像系统中拍照保存。 　　１．４ ＰＣＲ反应 　　ＰＣＲ反应体系为２０ μＬ，包括模板ＤＮＡ １ μＬ，１×ＰＣＲ Bｕｆｆｅｒ，２ ｍｍｏｌ/Ｌ ｄＮＴＰｓ １．５ μＬ，２５ ｍｍｏｌ/Ｌ ＭｇＣ