第一章 分子生物学的基本操作PPT课件.ppt

第一章 分子生物学的基本操作 分子生物学研究从20世纪中叶开始高速发展的最主要原因—— 现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。 在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，所以，DNA和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子（polyanions），把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。 在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。 1.2.4基因扩增 聚合酶链式反应，即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。 PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC) PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences PCR Cycle - Step 3 - At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated End of the 1st PCR Cycle – Results in two copies of target sequence Target Amplification 1.3 基因克隆的主要载体系统 碱变性法 在pH值介于12.0~12.5的条件下加热DNA溶液，使染色体DNA变为单链，而质粒DNA仍保持环状结构，当变性条件发生迅速变化时，前者仍不能复性，而后者又可回复到天然构型。 随机断裂产生的线性染色体DNA分子，彼此已经分离的互补链之间的复性作用就不会那么迅速而准确，往往聚集形成网状结构，与变性的蛋白质及RNA一道被离心沉淀下来。 用酒精沉淀法可以收集仍然滞留在上清液中的质粒DNA。 1.3.2 重要的大肠杆菌质粒载体 1.3.2.1.? pSC101质粒载体 1.3.2.2.??ColE1质粒载体 ColE1质粒属于松弛型复制控制的多拷贝质粒。在正常生长条件下，当培养基中用于蛋白质合成的氨基酸被耗尽，或是在对数生长末期的细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。此时，松弛型复制控制的质粒DNA仍然可以继续进行复制达数小时之久，使每个寄主细胞中所累积的ColE1质粒拷贝数增加到1000~3000个之多，质粒DNA大约可占细胞总DNA的50%左右。由此可见，由于质粒拷贝数高，插入的外源DNA片段的产量也就得到相应的提高。 ??? 1.4.2 重组体DNA分子的构建 1.4.2.2.?最佳连接反应 在连接反应中，正确地调整载体DNA和外源DNA之间的比例，是能否获得高产量重组转化子的一个重要因素。 当载体DNA与供体DNA的比值为1时，有利于重组体分子的形成。 思考题 称样 溶解 加热 制板 倒胶 电泳操作基本程序 取样 点样 电泳 检测 结果 1.将快速生长中的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球）。 ??? 所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。 处于能够接受外源DNA状态的细胞称为感受态细胞。 1.2.3 细菌转化 步骤： 2.与转化混合物中的外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。 3.立即将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激，复合物便会被细胞所吸收。 4.在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达、细胞活性恢复 5. 涂布于选择性培养基中分离转化子。 DNA 聚合酶 具有在核苷酸底物的存在下，以一条DNA链为模板催化新链的合成 需要具有 3’ -OH 的引物 具有 5’ 到3’ 方向聚合的能力 通常具有 3’到 5’ 外切酶活性 PCR技术的原理并不复杂： 一．DNA 体外扩增技术 1.??PCR反应体系 1) 基本原理 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依