[医学] 补充 基因重组与基因工程.ppt

 第一节 自然界的基因转移和重组 一、在细菌中遗传物质转移 接合(conjugation) 转化(tranformation) 转导(transduction)  E.coli 接合的发现: 1946年莱德伯格(Lederberg, J.) 和塔特姆 (Tatum) 发现细菌的接合（conjugation）。 细菌接合：指通过细胞的直接接触(如菌毛) ，遗传信息从供体细胞单向转移到受体细胞的过程。 二、DNA重组 概念： 不同DNA之间发生共价连接形成新的DNA 分子。 基因重组和移动是生物界普遍现象，是生物进化的动力，所以DNA重组具有重要的生物学意义 类型： 位点特异性重组（site-specific recombination） 同源重组（homologous recombination） 转座（transposition） 第二节 重组DNA技术 重组DNA技术相关概念及意义 重组DNA技术的原理及过程 重组DNA技术与医学关系 一、重组DNA技术相关概念及意义 重组DNA技术(recombinant DNA technology)：是指实现基因（或DNA）克隆所采用的方法及技术路线等。又称基因工程（gene engineering），遗传工程（genetic engineering）等。 （二）重组DNA技术的意义 填平了物种间不可逾越的鸿沟； 缩短进化时间； 对生物定向改造； 基因结构、结构功能及调控研究的基础； 疾病诊治 二、重组DNA技术的原理及过程 （一）工具酶 工具酶：系指能用于DNA和RNA分子的切割，连接，聚合，反转录等有关的酶系统称为工具酶。 常 用 的 工 具 酶 限制性内切核酸酶 (restriction endonucleases) DNA连接酶 (DNA ligase) DNA聚合酶I (DNA polymerase I) 多核苷酸激酶 (polynucleotide kinase) 反转录酶 (reverse transcriptase) DNA末端转移酶 (DNA terminal transferase) 碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase) 在DNA分子内部的特异性的碱基序列内部进行切割 将两条以上的线性DNA分子或片段 催化形成磷酸二酯键连接成一个整体 催化DNA 切口平移反应，制备高比活探针； DNA末端标记，合成cDNA的第二链 催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的 5’－OH末端上 以RNA为模板合成互补的cDNA链 线性双链 或单链DNA分子的3’－OH末端加上同聚物尾 去除DNA,RNA,dNTP的5’末端的磷酸基团 （二）基因载体（vector） 载体（vector）：携带目的DNA片段进入宿主细胞进行扩增和/或表达的一类DNA分子。 载体特征： 自主复制 即有复制原点（必需） 酶切位点（必需） 大小适合 筛选标记 如对抗菌素的抗性等 拷贝数高 载体类型： 来源: 质粒；噬菌体；病毒, 酵母人工染色体 功能: 克隆载型体和表达型载体 受体细胞: 原核细胞载体和真核细胞载体(穿梭载体) 1、质粒载体? 质粒：细菌染色体外小型双链环状DNA。 质粒复制的类型： 严紧型：1-5拷贝，与细菌复制密切相关 松弛型：10-200拷贝以上 常用载体： pBR322：4.36kb；人工构建 ；Tetr和Ampr；多克隆位点 pUC系列质粒： pBR322和M13噬菌体改建, 2.674kb；Ampr；蓝白斑筛选（lacZ，?-肽） 用途： 保存与扩增 2kb的目的基因 构建cDNA文库 测序 制备探针 2、噬菌体载体（bacterieophage） 基因组特点： 50kb双链DNA分子，末端12bp为互补单链（cos位点，又称粘端） 两个启动子：PR和PL 编码基因：包装蛋白，裂解功能蛋白等 生长方式： 裂菌性生长（组装噬菌体） 溶源性生长（整合入细菌DNA内） 载体种类： 插入载体（insertion vector）：外源性DNA直接插入酶切位点（EcoRⅠ） 容量：几个kb 代表载体：λgt10； λgt11 用途：构建cDNA文库 替代载体（substitutio