大肠杆菌基因工程PPT.pptVIP

包涵体型异源蛋白的表达 蛋白质的产量高 二硫键的断裂以及转译修饰作用的丧失，导致外源基因编码的蛋白质在大肠杆菌中超量表达 表达的质粒载体构建比较简单 * 包涵体型异源蛋白的表达 包涵体表达目的蛋白的缺点： 变性复性操作：以包涵体形式表达的重组蛋白丧失原有生物活性，无正确空间构象，必须通过有效的变性复性操作，回收具有生物活性的目标蛋白。 技术难题--变复性操作的效率，尤其当目标蛋白中的Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30% N-末端存在甲硫氨酸,影响蛋白质的真实性 蛋白质种类多，纯化比较复杂 * 包涵体型异源蛋白的表达 以包涵体形式表达目的蛋白的操作 包涵体的形成：若未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%以上时，倾向于形成包涵体 基因操作关键--选择高表达的载体 高表达率---包涵体法的优势 * 包涵体的变性与复性操作 蛋白质变性复性的动力学原理： N 天然状态的蛋白质 U 变性状态的蛋白质 C 共价修饰的蛋白质 A 集聚状态的蛋白质 I 有效变复性过程中的中间状态 X 脱离有效变复性过程而进入集聚的中间状态 C1 C2 Cn C U I 1 I n N X1 X2 Xn X Ag Ag Ag Ag 细菌内，集聚状态和共价修饰的蛋白质不能进入复性过程，无活性，包涵体中蛋白质属于这两种状