[医药]氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞.docVIP

氯化钙法制备感受态细胞 下面的方案是Clhen等（1972）所用方法的变通方案，常用于成批制备感受态细菌，这些细菌可使每微克螺旋质粒ＤＮＡ产生5x106-2x107个转化菌落，这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要。该方法完全适用于大多数大肠杆菌菌株，并且快速，重复性更好。该法制备的感受态细胞可贮存于-70℃，但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响。１）从于37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落（直径２－３mm），转到一个含有100ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约３小时（旋转摇床，300转/分）。为得到有效转化，活细胞数不应超过108细胞/ml，可每隔20-30分种测量OD600值来监测培养物的生长情况。在菌株与菌株之间，ＯＤ600值和每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测量特定大肠杆菌菌株的生长增减物在生长周期的不同时相的ＯＤ600值，并将各浓度的增减物铺于无抗生素的ＬＢ琼脂平皿以计算每一时相的活细胞数，从而使分光光度读数得到标化。２）在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至０℃。切记：下述所有步骤均需无菌操作。３）于４℃以4000转/分离心10分钟，以回收细胞。４）倒出培养液，将管倒置１分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。５