狂犬病实验室检测技术PPT.pptVIP

狂犬病实验室检测技术 ;一、实验室操作前的要求及准备 二、实验室检测方法 ;实验室操作前的要求及准备;（一）实验室条件及生物安全操作要求;4、个人防护 实验前要穿戴好防护服、眼镜、手套， 作好技术上的准备。 5、防止气溶胶扩散 由于空气传播狂犬病毒已经得到证实，因此高速混悬或离心操作应在密闭状态下进行。 6、实验后消毒处理 实验后要作好善后消毒处理, 狂犬病毒对脂溶剂（肥皂水、醚、氯仿、丙酮），45～70%乙醇，碘制剂和四铵化合物敏感，操作完毕对操作台、实验材料等要用相应的消毒剂或高压蒸汽进行消毒处理。 ;（三）实验前准备;实验室检测方法;（一）DFA 法（直接荧光抗体法） ——检测狂犬病毒抗原 ;荧光抗体的染色方法可分为两类： 直接法 — 荧光抗体直接与标本内的抗原反应, 优点简便、快捷、有效减少非特异性染色, 只适用于检测细胞内的抗原； 间接法 — 荧光抗体作为第二抗体，与直接结合胞内抗原的第一抗体反应, 既可检测胞内抗原，也可以检测体液中的特异抗体 相对直接法操作步骤增多 DFA原理： 抗体蛋白分子 + + 抗原→形成抗原抗体复合物→通过荧光显微镜→检测抗原 荧光素 ;操 作：;iv. 孵育： 将抗原片放在湿盒中， 37℃温育30 分钟； v. 洗片： 取出后，用缓流冲洗抗原片 3～5 秒， 再用 PBS 振洗 2 遍， 蒸馏水振洗 1遍，每次 2 分钟，吹干； vi. 封片镜检： 用 90％甘油（ PBS）封片，加盖玻片，荧光显微镜观察。 ;结果判断：;＋：荧光较弱，但清晰可见；;＋＋：荧光明亮，且多个视野均有分布； ;＋＋＋～＋＋＋＋：荧光闪亮，可见尼基氏小体清晰，且范围广泛；;;（二）巢式 PCR 方法——检测狂犬病毒核酸 ;巢式 PCR（nested－PCR）：;巢 式 PCR 方法的操作： ;（2） 以下步骤可在普通实验室进行 -70℃取出，室温融化→加 200μ l 氯仿， 快速颠倒 Epp 管数次（30 秒），使其呈淡粉红色 ↓ 室温放置 3min ↓ 4℃离心，12000rpm，15min （其间标记新的离心管，每管中加 600μ l 异丙醇） ↓ 取离心后水相 600μ l，加入新的离心管中，轻柔混匀 ↓ 室温放置 10 min （－20℃放置 30 分钟效果更佳） ↓ 4℃离心，12000rpm，10min ↓ ;缓缓倒掉上清，用枪头轻轻吸去残存液体，可见少量沉淀 ↓ 加 1ml 75％乙醇（DEPC H2O 新鲜配制）洗涤沉淀 ↓ 4℃离心 12000rpm，10min ↓ 缓缓倒掉上清，用枪头轻轻吸去残存液体，室温干燥数分钟 （加入 75％乙醇至－70℃可长期贮存 1～2 年） ↓ 脑组织的沉淀溶于 70ul DEPC H2O 中(2 个 EPP 管分装) [液体（唾液、尿液等）的沉淀 溶于 35ul DEPC H2O 中] ↓ 直接进行逆转录或－70℃贮存 ;注意事项： 1. 操作时一定戴口罩手套，保证离心管枪头无 RNA 酶 2. 一次提取核酸，样本数不要太多（10 个左右） 3. 加入氯仿后到加入异丙醇之前的操作应尽量快速且作用时间准确， 否则容易降低提取效率 4. 异丙醇和乙醇作用时间略长不影响结果 5. 加入异丙醇后所有的混均操作要轻柔，加液体时贴壁缓流，以免破 坏到所提核酸 6. 尽量缩短 RNA 在空气及室温的暴露时间，水溶的 RNA 一定要低温保存 7. 标本及时放回-20℃或-70℃ ;2、逆转录合成cDNA 1）pd(N)6 稀释至 0.2ug/ul 2）水浴预热至 65℃（其间标记反应管） 3）33ulRNA 液 65℃水浴 10min（其间准备冰盒或碎冰） 4）冰浴 2min，瞬时离心。 5）将液体转移至试剂盒反应管中 32ul，先不要混匀。 6）再向反应管中加入 1ul pd(N)6 0.2ug/ul 或特异引物各 0.5ul，使总体 积达到 33ul，室温 1min，混匀，瞬时离心。 7）37℃水浴，60min 8） -20℃或-70℃保存 cDNA ;