[工学]细胞工程实验总结.docVIP

实验一、细胞培养实验器材和试剂的准备1、哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。 材料：微孔滤膜(直径25 cm)：孔径为0.22μm、微孔滤膜(直径90 cm)：孔径为0.22 μm、过滤器(直径25 cm)。 仪器和器材：眼科剪刀和镊子、长镊子、培养皿、培养瓶、试剂瓶（或盐水瓶）、移液枪、10毫升试管、10毫升离心管、巴氏吸管、5毫升（或10毫升）吸量管、不锈钢过滤器、塑料过滤器、注射器、超净工作台、干燥箱、高压灭菌锅、正压泵。 适合于高压灭菌是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些耐高温的塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS等)。 2、细胞培养常用液体如何配制和灭菌？ 1）PBS 8.0g NaCl、0.2gKCl、2.2gNa2HPO4、0.12gKH2PO4溶于1000 mL双蒸水，高压灭菌，4保存。（准备试剂瓶） 高压灭菌2）干粉培养基过滤除菌 （先准备好不锈钢过滤器及滤膜，安装后高压灭菌，适度烘干；铝盒4个，三角瓶2个，容量瓶，不锈钢过滤器一套，酒精灯，酒精棉球3瓶，吸耳球3个，吸量管10毫升和5毫升各5根，分装用瓶，血清，超纯水，抗生素） 认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。 配制方法（1L）：1）在一个尽可能接近总体积的容器中加入大约500mL双蒸水。 2）在室温（20到30）的水中加入干粉培养基。 3）水洗袋内残留培养基，全部转移到容器内，轻轻搅拌，不要加热。 4）完全溶解之后，1袋1L粉状DMEM加3.7g NaHCO3，1mmoL∕L丙酮酸钠，即0.11g/L，添加双抗。 5）用双蒸水定容到1L，搅拌溶解。注意不要过分搅拌。 6）通过缓慢搅拌加入1N NaOH 或1N HCL调节pH值培养基在过滤前要保持密封。 7）立刻不锈钢过滤器过滤除菌，贴上标签，4保存备用。 高压灭菌3）胰蛋白酶-EDTA消化液 胰蛋白酶溶液配制：称取胰蛋白酶（1:250）粉末0.25g置烧杯中，溶于100mL PBS，搅拌混匀，置室温4 小时并不断搅拌振荡过滤除菌（若配制400 mL则应称取1g胰蛋白酶）过滤除菌。 EDTA 溶液配制：0.2g EDTA用400mL PBS溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶， 4冰箱保存。 高压蒸汽灭菌胰蛋白酶与EDTA 按1：1混合后分装，4冰箱保存。 4）抗生素液 双抗（青霉素、链霉素）各1克，溶于100mL纯水，过滤除菌，分装，4冰箱保存。使用前1：100稀释。 过滤除菌、简单介绍动物细胞培养实验室常用仪器的操作方法及注意事项。 操作方法2清洗1）新玻璃器皿的清洗2）使用过的玻璃器皿的清洗3）胶塞的处理 3 消毒1）物理消毒法 (2)干热灭菌 (4) 过滤除菌 （5）煮沸消毒 急2）化学消毒法 常用的消毒液有如下几种： (1) 70％(或75％)酒精 (2) 0.1％新洁尔灭(3) 来苏儿水(煤酚皂溶液) (4) 0.5%过氧乙酸(5) 乳酸蒸气 (6) 37%甲醛加高锰酸钾 (7)甲醛消毒方法 注意事项 1、清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗10-15次。清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。枪头和试管一定要用超声清洗处理后逐个清洗。2、干热灭菌时，应在白天使用烤箱，并不断观察，以免发生意外。当温度超过100时，不能再打开烤箱门。器皿烤完后，待温度降至100之下才能开烤箱门。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热灭菌方法。 3、高压灭菌后器皿务必晾干或烘干。 4、牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂均不能高压。需要长期保存的血清必须储存于-20—-80℃ 低温冰箱中。4冰箱中保存时间切勿超过1个月。血清在冻入低温冰箱前，不要装得太满，必须预留一定体积空间，（其他溶液冻存也是如此）。一般厂商提供的血清无需再过滤除菌。如发现血清有悬浮物，则可将血清加入培养液内一起过滤。血清解冻需采用逐步解冻法，切勿直接将血清从-20进入37解冻。在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀，使温度与成分均一待全部溶解后再分装。 5、滤过除菌时，滤器在使用前先装好滤膜，包好，经高压灭菌后才能使用。过滤前可用压进空气的办法测试过滤器是否完好，去除压力后针筒会反弹即为完好无损。滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。过滤时压力不宜过。装滤膜时位置要准确。另外滤器包装时，螺钉不要拧得太紧待高压灭菌之后，再拧紧使用。 6、使用化学消毒法时，配制75%酒精应用卫生级，不要用化学纯、分析纯和优质纯酒精。来苏儿水不能用于皮肤消毒。空气消毒时，所有的物品要事先准备齐全并使消毒者有较方便的退出途径。 7、培养基过滤器过滤除菌注意事项： (1) 细胞