[医学]免疫实验.doc

细胞与免疫学技术 1.实验报告、平时表现等占20%； 2.操作考试：占30%。 3.理论考试：（闭卷）卷面100分，占50%。 题型有判断题、填图题、问答题、实验设计。 实验前的准备工作—无菌操作 消毒灭菌方法 1.物理消毒灭菌法 紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿，如塑料培养皿、 培养板等 30min 湿热（高压蒸气灭菌法）：主要应用范围是布类、橡胶制品（如胶塞）、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液（如Hanks液、PBS等）。 121℃，20min 干烤：主要用于玻璃器皿的灭菌， 160℃, 2 小时 过滤：0.22μm 2.化学消毒灭菌法 75%酒精 主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理 1‰新洁尔灭 主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒 单克隆抗体的制备相关实验 1.细胞的原代与传代培养 2.细胞的冻存与复苏 3.ELISA的方法检测抗体 4.双向琼脂扩散实验 原代培养可分为消化法和组织块培养法。 传代培养的目的：当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。传代培养可获得大量细胞供实验所需。 细胞培养过程中所需要的培养用液 平衡盐液体 组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节pH值、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分 用于洗涤组织、细胞等 消化液 分离组织和分散细胞 常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液 单独或混合使用 培养细胞的结果观察 24～48小时后若培养液变成黄色且混浊，表示已被污染； 若培养液变成紫色，一般细胞生长不好，则培养液pH过高； 若培养液显为橙黄、橘红且清澈，一般显示细胞生长良好。 细胞冻存与复苏[实验原理] 细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196度液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买，寄赠，交换和运送某些细胞。 冷冻保护剂的作用 冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。在溶液中加入冷冻保护剂，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条件下保存 。 如何运用“缓慢冻存，快速复苏”的原理保存细胞？(细胞冻存的实验步骤) 查出四个大方格的总细胞数(X) 算出每个大方格的细胞数：Y=X/4 每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y ×104×稀释倍数 ELISA实验原理 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA ）：以待测抗原（或抗体）与酶标抗体（或抗原）的特异结合反应为基础，通过酶活力测定来确定抗原（或抗体）含量。 因为结合了免疫反应和酶催化反应，所以是一种特异而又敏感的技术。 间接ELISA 此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定。 双抗体夹心法。此法常用于测定抗原, 将已知抗体吸附于固相载体, 加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定。 双抗体夹心法。此法常用于测定抗原, 将已知抗体吸附于固相载体, 加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定。 竞争法。此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。以测定抗原为例, 将抗原吸附于固相载体；加入待测抗原和一定量特异性抗体，使固相抗原与待测抗原二者竞争与抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的抗体与待测抗原含量呈负相关。 双向免疫扩散实验原理 双向免疫扩散实验是将抗原抗体分别加入琼脂板相对应的小孔中，使二者相互扩散，在比例适当处形成可见的沉淀线。我们通过观察沉淀线的位置、数量、形状以及对比各沉淀线的关系可对抗原或抗体进行定性分析，常用于抗原抗体纯度的鉴定，也可以对抗体的效价进行初步估算。 加样、扩散及结果观察 注意：加样至孔满为止，不可外溢。待孔内液体渗入凝胶后即可放于温盒中。湿盒于37℃中，一般保温24～48h，观察抗原抗体产生的白色沉淀线。 免疫学经典实验 1. 淋巴细胞转化实验 2. 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬实验