[农学]高效降解纤维素混合菌株的选育.docVIP

高效降解纤维素混合菌株的选育 本研究从垃圾堆肥，腐烂稻草，秸秆，树叶植被覆盖的土壤中采集，采集地点在学校工厂周围，天气阴天，周围环境干燥。根据多过采样点来弥补菌种种类少的缺点，更加有利于我们以后菌种来源广，酶系组成更全；利用菌种之间存在的共生特性，将不同的菌种进行混合培养进行发酵，以弥补单菌酶组分不全，活性不高的弱点。 分离筛选路线图 样品采集 富集培养 滤纸崩解测试 分离纯化 初筛 { 单菌筛选———{ 刚果红识别 组合单菌 复筛 ——产酶测试 固态产酶测试 确定目标混合菌 目标混合菌鉴定 紫外线诱发突变 ——固态产酶测试 1富集培养 富集培养基 KZHPO40.2%， (NH4)25040.14%， MgS04.7HZO0.03%， CaC120.03%， Feso4· 7HZo5x10一4%， Mnso4i.6xio一4%，znso4i.7xio一4%，eoel22xio一4%， 滤纸条2%，pHS.5，i21oC灭菌3omin。 富集培养是在目的菌种含量比较少时，根据能够分解纤维素菌种的生理特性，设计一种选择性培养基，创造有利于该菌种生长条件，使目的菌种在适合的环境下迅速的生长繁殖，数量增加。有利于分离到需要的菌种。 把各种样品向各品瓶中注入50mL左右的无菌水，加玻璃珠充分振荡，以洗下样品上的微生物，静置，三层灭菌纱布过滤，再静置，取滤液中的上清液lmL接种于250mL装有增殖培养基50mL的三角瓶中。随后将装有含取样菌增殖培养液的锥形瓶置于摇床上以300Or/min、30℃培养72h。培养结束之后，再将其中的滤纸转入无菌的新鲜增殖培养基中，反复3次，使利用纤维素的菌株得到富集。 2菌株分离 2、分离平板培养基—梭甲基纤维素培养基(CMC培养基): CMC一 Na15克， NH4No3 1克，酵母膏1 克，Mgso4· 7H2o 0.5克，KH2Po4;1克 H2O 1000mL，琼脂2%，pH自然，121oC灭菌30min 在富集培养之后，为进一步分离纯化目的菌株 1、移取富集培养液0.lmL于CMC一Na培养基上作平板涂布，30℃恒温培 养。待平板上长出菌落后，立即挑取，并在CMC一Na平板上进行划线分离，随 后将长出的单个菌落接种于斜面培养基上进行保存。 2、从富集培养液中挑取己溃烂的滤纸片点种于CMC一Na培养基平板30℃恒温培养，观察培养基上滤纸的形态变化，及其菌株的生长状况 通过对采集到的样品进行富集培养，并分别对其形成的富集培养液进行平板涂布、划线分离，共分离得到单菌15株。 3各菌株的形态特征 菌种编号 形态特征 1 菌落呈圆形放射线状，白色干燥。 2 菌落白色绒状，菌丝体覆盖整个平板，且干燥。 3 菌落最初为白色绒状，而且呈颗粒固体状态，后逐渐变为青色，最后全部变为青色，且干燥。 4 菌落圆形初为白色，约72小时后变为黄色，湿润。 5 菌落圆形 初为白色，22小时后菌落中心出现青黑色，菌落圆形干燥。 6 菌落白色绒状向外辐射，干燥培养一短时间变为咖啡色 7 菌落呈丫枝状向外辐射，为白色 8 单菌落为白色，较大的圆形，干燥。 9 菌落极细小的白色圆形，湿润，密布于怎个平板。 10 菌落初为白色，细小的圆形，湿润。 11 菌落为浅黄色，极细小的圆形，比较湿润。 12 菌落为圆形，黄色很湿润，易挑取。 13 菌落为白色，在菌落周围有一圈白色水圈， 14 菌落为白色，菌落中有一条螺旋线条 15 菌落呈绒状白色 通过菌种分离得到15种细菌，把每一种菌种分别放入250ml的锥形瓶中再一次通过富集培养，培养情况如下表 组号 时间 滤纸条分解情况 效率% 1 72小时 滤纸条分解但是不完全 80% 2 72小时 滤纸条分解但是不完全 56% 3 72小时 滤纸条分解完全 100% 4 72小时 滤纸条分解但是不完全 88% 5 72小时 滤纸条分解完全 87% 6 72小时 滤纸条分解但是不完全 90% 7 72小时 滤纸条分解完全 100% 8 72小时 滤纸条分解但是不完全 75% 9 72小时 滤纸条分解但是不完全 94% 10 72小时 滤纸条分解完全 100% 11 72小时 滤纸条分解完全 100% 12 72小时 滤纸条分解但是不完全 89% 13 72小时 滤纸条分解完全 100% 14 72小时 无变化 0 15 72小时 无变化 0 16对照组 72小时 无变化 0 根据实验对比可知14和15组细菌不能够产生分解纤维素将的酶。 滤纸崩解测试 滤纸条鉴定培养基 （NH4)SO4;0.10%，KH2PO4;0.10%， MgSO