间接免疫荧光在免疫组化中的应用PPT.pptVIP

免疫荧光技术在免疫组化中的应用 王晓旭目录 免疫组化的基本概念 免疫组化的分类 免疫荧光法 免疫荧光的分类 常见荧光素及其特性 荧光抗体的制备 免疫组化的基本操作步骤 免疫组化的基本概念 免疫组化，是应用免疫学基本原理，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性及定量的研究。 免疫组化的分类 免疫组织化学技术按照标记物的种类可分： 免疫荧光法 免疫酶法 免疫铁蛋白法 免疫金法 放射免疫自显影法 免疫组化的分类 免疫组化实验常用的组织标本： 组织标本 石蜡切片 冰冻切片 组织印片 细胞标本 细胞爬片 细胞涂片 免疫荧光方法 免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。 免疫荧光方法的分类 免疫荧光方法的分类 免疫荧光方法的分类 常见荧光素及其特性 FITC：黄色结晶粉末状，吸收光490 ~ 495 nm，发射光520~530nm，明亮的黄绿色荧光 RB200：橘红色粉末，吸收光为570nm，发射光为595~600nm，橘红色荧光 TRITC：紫红色粉末，吸收光为550nm，发射光620nm，橙红色荧光 PE：吸收光490~560nm，发射光595nm，红色荧光。 其他：镧系（Eu、Tb），酶作用后产生荧光物质 常见荧光素及其特性 荧光抗体的制备 （一）.荧光素与抗体的结合（标记） 透析法： 1、将含10mg/ml的Ig溶液10ml装入透析袋 2、将透析袋放入100ml含有0.1㎎/ml FITC的碳酸盐缓冲液（pH=9.4）烧杯中 3、4℃磁力搅拌24小时 4、取出透析袋，进行纯化、鉴定 荧光抗体的制备 搅拌法 1、将含40㎎/mlBP溶液5ml装入反应瓶中 2、加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐缓冲液4ml 3、25℃磁力搅拌下，逐滴加入1ml含2㎎的FITC溶液 4、25℃下搅拌1h，4℃下继续搅拌4h，然后进行纯化鉴定 荧光抗体的制备 （二）荧光抗体的纯化： 1、除去未结合荧光素 将标记后的抗体溶液装于透析袋，于流动的自来水中透析约10min，然后移入pH=7.4的磷酸盐缓冲液中，在4℃才透析，直至透析外液在紫外灯下不呈现荧光为止 荧光抗体的制备 2、除去标记不适当的抗体 采用DEAE纤维离子柱。将DEAE纤维素用pH=7.6的0.01mol/L磷酸盐缓冲液平衡装柱，加入标记抗体溶液，进行分步洗脱。 未结合荧光素的抗体，所带负电少，最先洗出。 过量结合荧光素的抗体，所带负电多，最后洗出。 荧光抗体的制备 3、除去非特异反应物质 将荧光抗体用同一正常组织或同种动物其它组织的组织粉预先吸收。 按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合，4℃磁力搅拌1h，静置1h,离心取上清液，在用50㎎/ml比例重复一次 荧光抗体的制备 （三）荧光抗体的鉴定： 分光光度法，并按照下式计算： FITC：F/P=2.87*A495/(A280-0.35*A495) F/P值高，则抗体分子结合的荧光素多 固定标本染色以F/P=1.5左右为宜 活细胞染色以F/P=2.4左右为宜 免疫组化操作步骤 （ 1 ）、石蜡切片脱蜡至水。 　　（ 2 ）、 3%H 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 　　（ 3 ）、蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。 　　（ 4 ）、 5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟，倾去血清，勿洗。滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小时或 4 ℃ 过夜。 　　 免疫组化操作步骤 （ 5 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。 　　（ 6 ）、滴加适量 生物素标记二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。 　　（ 7 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。 　　（ 8 ）、滴加适量的 辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。 　　（ 9 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3