- 1、本文档共3页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
- 5、该文档为VIP文档,如果想要下载,成为VIP会员后,下载免费。
- 6、成为VIP后,下载本文档将扣除1次下载权益。下载后,不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 7、成为VIP后,您将拥有八大权益,权益包括:VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 8、VIP文档为合作方或网友上传,每下载1次, 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等,对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
[医药]吴群峰_杆状病毒表达系统昆虫细胞的培养及杆状病毒滴度测定
杆状病毒表达系统(昆虫细胞的培养及杆状病毒滴度测定)
吴群峰 2010-7-10
1.昆虫细胞的培养:
Insect Cell Lines:
Sf9 or Sf21 cells——主要用于转染,空斑纯化和滴度测定
High Five? cells or Mimic? Sf9 cells——转染效率低,主要用于蛋白表达
Graces Insect Medium with L-glutamine and supplemented with(pH 6.5): 3330 mg/L lactalbumin hydrolysate 3330 mg/L yeastolate
350 mg/L NaHCO310% heat-inactivated fetal bovine serum
Atmosphere:air, 100% Temperature:28.0 °C
Growth conditions: The recommended media are formulated for use without CO2. Omission ofthe yeastolate or lactalbumin hydrolysate will lead to poor performance by this line.
Subculturing:Gently resuspend cells in the spent culture medium by pipetting across the monolayer or scraped by cell scrapers or by hitting the flask against the palm of your hand (175 flask).
Preservation:Freeze medium——90% serum, 10% DMSO
严格程序降温,过夜后转移液氮保存
2.转染:细胞70%-80%覆盖率aculovirus DNA与脂质体 轻轻 混匀
3.扩增病毒:接毒量为MOI=0.05~MOI= 0.1
需要的病毒量(ml)=
比如:P1代毒滴度为5 ×106 PFU/ml,细胞量2×107 cells/ml,那么
需要的病毒量(ml)=
=0.4 ml
表达蛋白:接毒量为MOI=1~MOI=5
4.杆状病毒滴度测定:
两种病毒滴度测定方法的比较:
空斑实验法测定滴度依赖于病毒在感染细胞中的复制以及感染周边细胞形成局造型病变;而免疫染色法只需要病毒感染靶细胞并表达病毒所编码的蛋白。因此,免疫染色法(the results of immunostaining expressed as infectious units per ml, or IFU/ml)测定病毒滴度需要的时间比空斑法(the results of the plaque assay expressed as plaque-forming unit/ml, or PFU/ml)更短(Table 1)。
Table 1: Comparison of Titration Methods
Measurements What is required? Virus replication
required? Detection of virus by immunostaining
(Rapid Titer Kit) Virus must infect cells and express viral protein (PRRSV:N protein; Baculovirus:Gp64) NO Plaque assay or endpoint dilution assay (PFU/ml) Virus must infect cells, replication and then infect surrounding cells YES
BacPAK? Rapid Titer Kit:
本测定方法,以针对杆状病毒囊膜蛋白gp64的单克隆抗体标记被病毒感染的细胞,然后以HRP-标记的二抗对感染细胞进行染色。通过底物显色,在光学显微镜下计数感染斑点的数量,经过稀释倍数的换算,即可得出病毒的滴度(IFU/ml)。
本病毒滴度测定的关键点:
细胞铺板5 ×106 cells/well,细胞计数要准,台盼蓝染色。
病毒稀释要准,不同浓度之间换枪头。
整个过程中,轻轻洗板,避免细胞脱落过多。
实验完毕3 h后数斑。
结果判定:
3
Immunoassay:
Fix cells
Detection with an anti-AcM
您可能关注的文档
- [一年级英语]1年级英语2009-2010学年度第二学期.doc
- [中学教育]高二物理机械振动课件二.ppt
- [中考]通用新课标推荐名著10部专项测试.doc
- [中考数学]图形运动基础练习.doc
- [中考理化生]2011年重庆江津区初中毕业暨高中招生化学试卷.doc
- [中考理化生]物理试验题.doc
- [中考理化生]2011年上海市中考化学试卷及答案word.doc
- [中考理化生]浅谈如何实施初中物理有效教学.doc
- [中考英语]2011年中考数学压轴题复习讲义:动点问题详细分层解析一.doc
- [中考英语]2010年中考英语试题[130套]分类汇编专题-词汇运用.doc
- 上海海洋大学《海洋环境分析技术》课件-21化学发光分析法.pdf
- 上海海洋大学《海洋环境分析技术》课件-20分子荧光分析法.pdf
- 上海海洋大学《海洋环境分析技术》课件-22色谱分离过程.pdf
- 上海海洋大学《海洋环境分析技术》课件-25气相色谱仪与固定液.pdf
- 上海海洋大学《海洋环境分析技术》课件-24色谱定性定量方法.pdf
- 上海海洋大学《海洋环境分析技术》课件-26气相色谱检测器.pdf
- 上海海洋大学《海洋环境分析技术》课件-29液相色谱固定相与流动相.pdf
- 上海海洋大学《海洋环境分析技术》课件-27气相色谱分离条件的选择.pdf
- 上海海洋大学《海洋环境分析技术》课件-28液相色谱仪器与类型.pdf
- 上海海洋大学《海洋环境分析技术》课件-3 原子光谱和分析光谱.pdf
文档评论(0)