转基因技术在动物遗传改良上的应用进展.docVIP

转基因技术在动物遗传改良上的应用进展 　　摘要：简要介绍了几种比较常用的转基因方法，包括显微注射法、脂质体介导法、电转染法、胚胎干细胞法、病毒载体法、精于载体法、卵巢直接注射法。传统的转基因方法与基因打靶、体细胞核移植、RNA干扰以及线粒体转移技术相结合，在基因功能研究和疾病治疗中发挥越来越重要的作用。特别是近年来在植物上出现的外源基因清除技术，为我们在动物上彻底去除外源基因的影响提供了新思路。 　　关键词：转基因技术；动物；外源基因：遗传改良 　　中图分类号：Q812；S813 文献标识码：A 文章编号：0439-8114(2009)02-0481-06 　　 　　动物转基因技术是将外源基因导入人或动物细胞内，使外源性基因整合在染色体基因组上并稳定的传给下一代。1976年。Jaenisch等利用反转录病毒感染胚胎的方法进行基因转移，这是最早的动物转基因方法的应用。随后各国研究者相继在小鼠、大鼠、兔、绵羊、猪、山羊、鸡、蛙、鱼类等动物上获得成功，使用的方法也不尽相同，包括显微注射法、脂质体介导法、电转染法、病毒载体法、精子载体法等。传统的转基因方法与前沿的生物学技术如基因打靶、体细胞核移植、RNA干扰等相结合，越来越显示了其强大的生命力。随着转基因动物技术的发展，转基因产品已经广泛渗透到医疗、卫生、农产品和食品等中。 　　 　　1　动物转基因技术 　　 　　1．1 显微注射法 　　显微注射法(microiniection)是指通过显微操作仪将外源基因注入受体动物受精卵的细胞核中，外源基因整合到受体细胞染色体上，发育成转基因动物的技术。1980年，Gordon等L2)利用显微注射的方法将构建的HSV-Tx融合基因转入小鼠的基因组，在得到的78只仔鼠中有2只为转基因动物。1982，Palmiter等L3)应用显微注射技术成功地将大鼠的生长激素基因注射到小鼠受精卵的雄原核中，获得了整合并表达外源性生长激素的超级转基因“硕鼠”。 　　显微注射法是发展最早、使用最为广泛也是最，为有效的转基因方法之一。Zhu等利用显微注射法生产出转sFat-I基因小鼠。Tang等利用此法制备㈩乳腺中可表达重组抗CD 20抗体的转基因小鼠、Manoi等将TAIL-PCR技术用于分析显微注射导致的整合位点不确定中，进一步拓展了该方法的应用范围。目前，利用此方法已成功的生产出了小鼠、兔、绵羊、猪、牛、鱼和鸡等各种转基因动物。 　　 　　1．2 脂质体介导法 　　脂质体(liposome)特别是阳离子脂质体(cation-ic liposome)目前是实验室进行转基因研究的一种常规方法。该方法具有生产简便、毒性低、无感染危险等优点。有别于其他类型的脂质体，阳离子脂质并不将DNA包裹在其脂质双分子层中，只需将二者直接混合即可得到一种稳定的复合物――liooplexes，因此，复合物的形成不受DNA体积大小的限制。 　　 　　1．3 电转染法 　　自Muramatsu等将电转染(eleetroporation)应用于小鼠睾丸细胞获得成功以来，电转染目前已成为基因转移的高效且常规的手段之一。董菊子等对转染前孵育温度、渗透压、电转染参数、细胞周期等对电转染效率有影响的因素进行了系统研究，摸索出电转染的合适条件。Umemoto等将pCA GGS-lacZ基因电转染小鼠睾丸并设计了一系列对照，结果电转染对小鼠后代的数量并无显著影响。Nataeha等川在研究改进一种新的WISH方法时也使用了电转染方法。 　　 　　1．4 胚胎干细胞法 　　胚胎干细胞(ESC)是从早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜能细胞系，注射于动物囊胚后可参与宿主的胚胎形成嵌合体，直至达到种内嵌合，因此可将其作为一种载体，导入外源基因，获得转基因动物。Capeeehi等首先对小鼠ES细胞进行了基因打靶，然后将此打靶的ES细胞移植进入小鼠囊胚，将此重组胚移植进入代孕母鼠，最后产出嵌合体仔鼠，通过相互交配获得基因敲除的纯合小鼠。ES细胞介导技术是公认的研究基因转移、基因定位整合的一类极有前途的实验方法。此法可使受体动物细胞中基因整合率达到50％，其中生殖细胞整合率达30％。目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。 　　 　　1．5　病毒载体法 　　目前使用较多的是逆转录病毒感染法(retro-virus-mediated gene transfer)。该方法是利用逆转录病毒DNA的长末端重复序列(LTR)区域具有转录启动子活性这一特点，将外源基因连接到LTR下部进行重组后，包装成高滴度病毒颗粒，直接感染受精卵，或微注入囊胚腔中。携带外源基因的逆转录病毒DNA可以整合到宿主染色体上。1974年，Jaenish等将SV40 DNA注入小鼠