PCR引物设计及相关软件使用解读.pptVIP

搜索结果 28对引物 引物分值 100分为满分 每对引物的信息 双击选中一对引物 * 引物信息 回到主窗口 引物及产物信息 是否出现hairpin,dimer,false priming and cross dimer * 一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有 But … * 引物编辑 * 引物编辑 Edit primer here Analysis the edit result Accept the edit result Return to the main window * Some other useful function of PP5 * Enzyme * Melting temperature graph Per 25-mer * GC% graph Per 25-mer * Stability Per 5-mer * 心肌特异性表达双顺反子载体的构建 PMYL2 EcoRI * pIRESneo－2 质粒克隆扩增 MYL2序列查询及 启动子功能分析 不加酶切位点引物设计 基因组DNA制备 高保真PCR Cloning 大量纯化的MYL2 promoter片段 酶切获得无promoter 线性质粒载体片段 DNA　Ligation Reaction 转入DH5a Colony Screening PCR Identification MYL2promoter pIRESneo pEGFP-c3 质粒克隆扩增 酶切获取MYL2promoter Plasmid vector开环分子 酶切获得EGFP片段 酶切及凝胶电泳鉴定及回收 环状DNA分子 DNA　Ligation Reaction 环状DNA分子 转入DH5a Colony Screening PCR Identification rat原代胚胎心肌细胞培养及冻存 MYL2promoter　pIRES/neo/EGFP 心肌细胞 脂质体 荧光鉴定 rat心肌细胞特异表达EGFP 无绿色荧光蛋白表达 达到目的 两端不含酶切位点的 MYL2/prmoter片段 5端含酶切位点的引物 PCR 两端含酶切位点 MYL2/prmoter片段 TA克隆 Strategy of Construct * MYL2序列查询及分析 * * * * * * * * * * * * * * Primer5.0软件安装及引物设计 网上下载软件 利用密码生成机破解软件并激活软件 * 心肌特异性表达载体构建 线性载体准备 酶切 * PCR引物设计及相关软件使用 重庆大学生物工程学院　杨应斌 * 主要内容 背景 PCR引物设计原则 常用PCR引物设计软件 Primer Premier 5.0 介绍 Oligo 6.22 介绍 在线Primer3 介绍 * PCR 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。 * PCR 引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。 * 引物设计的原则 引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 * 影响因素 如引物长度（primer length），产物长度（product length） 序列Tm 值(melting temperature) 引物与模板形成双链的稳定性(internal stability, 用?G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值 * 在错配位点（false priming site）的引发效率 引物及产物的GC 含量（composition），等等。 必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。 * 一般原则 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是