[农学]第7章 酶的定向进化-2010.ppt

第七章 酶的定向进化 内容 概述 定向进化的特点 突变技术 筛选技术 定向进化的应用 概述 天然酶应用过程中出现问题（改造动机）1 天然酶的稳定性差、活性低使催化水平很低、缺乏有商业价值的催化功能；2 越来越多的情况需要一些酶催化很多在自然界中并不存在的各种底物来完成特定的反应过程 根源: 天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。而自然的酶只能满足自然界中生命体（而非人类社会）的需要 实验室进化 随机突变+定向选择＝目标突变体 定向进化:对特定基因直接突变+定向选择 定向进化的基本过程 第一节 定向进化的特点 一 适合范围广 不同于理性设计，要求事先了解酶蛋白结构 二 目的性强 突变针对特定基因定向进行 筛选针对特定功能进行，如热稳定性 三 效果显著 短时间完成酶在自然界中几千年进化历程，且进化方向符合人类社会需求。 理性设计与非理性设计的对比 理性设计（定点突变，杂合）对蛋白结构和功能关系比较清楚，设计一定蛋白结构（如一级结构的氨基酸序列）来改变蛋白功能 非理性设计（定向进化）无需知道蛋白结构和功能关系，直接筛选适合（催化）功能的蛋白酶，再了解这些高活力酶蛋白对应的结构 半理性设计(semi-rational design)结合了两种方法的优点，它在定向进化的基础上加入了理性设计的元素，将随机突变限制在一个或几个残基上，可以有效的在一个较小的突变库中获得性质改善的突变体，可以大大提高获得阳性突变体的几率 两种方法打通了结构到功能关系，通过结构预测功能或通过功能了解结构，使人类对蛋白结构和功能关系有了更深入的了解，因此成为蛋白工程的两样有力工具 因为通过定点突变可以向序列中引入关键残基和结构元件,从而在定向进化中增加有益突变重组的频率。另外,定向进化增加了理性设计知识,从而减少了随机突变的序列空间,甚至为理性蛋白质设计提供突变目标 第二节 基因的突变技术 PCR技术介绍 一 易错PCR（error-prone PCR) 原理:通过降低传统PCR中一种或者两种dATP dGTP dCTP dTTP 的浓度并且加入一定量的MnCl2，同时采用低保真度的TaqDNA聚合酶。使基因在扩增时能随机的创造突变。遗传变化只发生在单一分子内部,故属于无性进化(asexual evolution) 操作手段：１）降低氯化镁的浓度 　　　　　 ２）是添加氯化锰 　　　 ３）是降低其中某一种单核苷酸的浓度或者用核 苷酸三磷酸盐类似物替代其中一种单核苷酸 关键：选择适当的突变频率 优点：快速、简便、操作方便 缺点：它比较费力耗时,一般适用于较小的基因片段( 800bp） 二 DNA改组（DNA Shuffling) 改进1：交错延伸技术(StEP) 1998 年, Arnold 等人又建立了一种新的体外重组方法交错延伸技术。 原理：用PCR 同时扩增多个拟重组的模板序列时,在热循环中大大缩短退火与聚合酶催化延伸的时间 。 优点：多样性，操作简单，无需片段纯化，重组发生在单一试管中 缺点：依赖于序列同源性，目的基因特异性的PCR条件优化耗时 改进 2 随机引导重组(RPR) 1998 年, Arnold 原理：用随机序列的引物来产生互补于模板序列不同部分的大量的DNA 小片段 。 主要优点： 　　1) 合成的随机引物长度一致并缺乏序列的偏向性（不要求等位）,　保证了点突变和交换在全长的后代基因中的随机性。 　　2) 随机引导的DNA 合成不受DNA 模板长度的影响,　有利于小肽的改造。 三 基因家族重排技术 该重排技术和DNA重排技术大致相同。 区别在于基因家族重排所用同源基因重排，而后者使用重同一基因易错pCR获得的点突变进行重排。 同源性高，获得杂合体几率低 第三节定向进化的筛选技术 在定向进化中尽管突变体具有随机性，但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实验条件限制突变种类降低突变率缩小突变库的容量，不仅减少了工作量更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。 手段: 高通量筛选体系和超高通量筛选体系建立。（对比以前的挑单菌落摇瓶复筛，筛选数目多，试剂少，信号灵敏，自动化程度较高） 1 平板筛选技术 1）根据细胞生长情况筛选突变基因 热 抗生素 pH 高渗透压 低温 有毒物及抑制剂 2） 依据颜色变化筛选 ?颜色变化是最简便的追踪酶反应的方法，如用对硝基苯基衍生物检测水解酶的活性。根据水解释放出的黄色对硝基苯酚或对硝基苯胺来进行检测。下图显色底物可检测葡萄糖苷酶。 碱性条件显色pH8 大多数酶并不能直接引起颜色变化，为了检测一个没有生色集团的底物的反应，需要将反