[农学]微生物工程.ppt

菌种分离思路 定方案 标本采集 标本材料的预处理 菌种筛选 发酵性能测定 菌种保藏 定方案 生产实际需要， 目的产物， 生活环境 施加选择性压力分离法 　　富集培养：所需微生物数量非常少 原理：不同微生物对培养条件要求不同 可施加的压力： 氧气　温度　PH　离子浓度　… Exp：试剂使用对分离的影响 施加选择性压力分离法 培养方法： 分批式富集培养 恒化式富集培养 Exp：筛选共生菌群 固体培养基的使用 随机分离方法（一） 生长因子产生菌的分离 背景：生长因子的产生不能作为选择的压力 原理：分离菌能否促进营养缺陷型菌株生长 方法：影印法 微生物的育种 目的 方式： 自然选育 诱变育种 杂交育种 基因工程技术 … 自然选育 原理：利用微生物的自然突变 多因素低剂量的诱变效应 互变构效应 特点（适用范围）： 方法： 诱变选育 原理： 染色体畸变，基因突变 诱变剂 基因突变频率：自然：10-8~10-9 方法： 诱变 筛选 突变菌株的筛选 筛选：初筛，复筛，发酵条件的优化研究 变异种类： 酶的改变 酶活性降低 酶活性提高 酶量的增加／减少 酶构型改变（抗阻遏抑制／抗反馈抑制） 新的代谢能力（无新基因出现） 细胞膜透性改变 抗性突变 … 酶的改变四：渗漏缺陷型的利用 渗漏缺陷型： 遗传性障碍不完全的突变型． 合成少量的最终产物 无反馈抑制 酶活性增加的育种 长久施加选择性压力提高酶活性 方法：恒化器培养 Exp：酿酒酵母的育种 原有性状：PH6时，酸性磷酸脂酶活性不高 恒化器培养：β-甘油磷酸盐作为唯一碳源，PH6培养 结果：利用率提高30%，最适PH为PH6 抗阻遏抑制和抗反馈抑制突变 阻遏抑制和反馈抑制 结构类似物 抑菌作用，筛选作用 Exp：亮氨酸和5,5,5-三氟亮氨酸 CH3 NH2 CH3-CH-CH2-CH-COOH 　鼠伤寒沙门氏菌 回复突变(一) 获得抗反馈的突变型 机理：发生突变?失活?再次突变 步骤： 1、筛选某缺陷型 2、育种，挑选回复突变型 3、进一步筛选 4、测试发酵性能 综合措施育种 同一个菌株中，多种突变型同时应用 可用的突变方式： 营养缺陷型?中间产物积累 抗阻遏、抗反馈抑制型 Exp：三重突变型 组成型突变（一） 诱导型 VS. 组成型 筛选方法一：抑制诱导酶合成的物质 筛选方法二：交替培养 … 　　乳糖培养基 　　葡萄糖培养基 　　甘油培养基 基因表达系统 选择标准： 目的基因的高效表达 基因表达系统： 原核表达系统： 大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 链霉菌 真核表达系统： 酵母 丝状真菌 大肠杆菌的表达系统（一） 大肠杆菌的优点 对其研究深入 生长繁殖迅速 基因工程表达的产物多种多样 大肠杆菌的缺点 无信号肽，不分泌，提取困难 不修饰蛋白质 甲硫氨酸残基的影响 大肠杆菌的表达系统（二） 表达载体 基因要与合适的表达载体连接 独立复制 严紧型复制 松弛型复制 克隆位点和筛选标记 强启动子　　强终止子 有阻遏子 产生的mRNA有翻译起始信号 大肠杆菌的表达系统（三） 影响基因表达的因素 基因的拷贝数 表达效率 启动子的强／弱 核糖体结合位点 密码子组成 产物的稳定性 非融合型／融合型 细胞的代谢负荷 大肠杆菌的表达系统（四） 大肠杆菌中真核基因的表达形式 融合蛋白 非融合蛋白 分泌型表达蛋白 酵母菌的基因表达系统（一） 载体系统：克隆载体　表达载体 如：α1因子的前体序列 影响基因表达的因素 拷贝数 表达效率 组成型启动子 诱导型启动子 分泌信号 终止序列 外源蛋白的糖基化 宿主菌株的影响 菌种的保藏方法 保藏原理 保藏方法 斜面低温保藏方法 液体石蜡保藏法 沙土管保藏法 冷冻干燥保藏法 液氮保藏法 … 分支生物合成途径的调节 分支生物合成（图） 调节方式：（图） 同工酶调节 协同反馈调节 累加反馈调节 增效反馈调节 顺序反馈调节 联合激活或抑制调节 酶的共价修饰 能荷调节 改变细胞膜通透性—谷氨酸的生产（一） 资料来源：焦瑞身等, 微生物工程. 化学工业出版社, 2003，P.72 谷氨酸生物合成中的调节 细胞膜通透性的调节 磷脂的合成 生物素 表面活性剂 青霉素的作用 谷氨酸输送蛋白 改变细胞膜通透性 —谷氨酸的生产（二） 育种要点： 提高细胞膜的通透性 溶菌酶敏感 二氨基庚二酸缺陷型 温度敏感 强化能量代谢 解除反馈抑制 切断/减弱代谢支路 增加前体 营养缺陷型 改变细胞膜通透性 —谷氨酸的生产（三） 生产工艺：