内蒙古大学基因工程原理实验方案设计作业.doc

热滞蛋白（抗冻蛋白）基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 基因名称：热滞蛋白，也称抗冻蛋白AFP。（TmAFP） 所属物种：黄粉虫Tenebrio molitor（粉虫甲属，原产北美洲） NCBI登录号：AF159115/nuccore/AF159115 基因功能:抗冻蛋白（Antifreeze proteins ，AFP）能保证物种在零下温度环境下生存，抵抗0℃以下的冻害。这种蛋白可以通过非共价吸附抑制机制吸附到冰核表面或屏蔽异源冰核阻止结冰，限制冰晶生长和抑制冰晶重结晶，从而保护有机体免受结冰引起的伤害。抗冻蛋白与哺乳动物细胞膜相互作用，保护细胞膜不会被冻坏。这种蛋白参与生物体对冷气候的适应过程。 实验目的：提取转基因原核生物中大量诱导表达的抗冻蛋白，作为防冻剂，应用于对农作物的冬季储藏和保鲜。 mRNA序列：1 aaactatggc attcttaacg tgtggttttt caaaaaaatg gttagtaata gcagttatag 61 ttatgtgctt gtgtaccgag tgttattgcc aatgcactgg gggttctgat tgtactagtt 121 gtacagcagc atgcactggt tgtggaaact gtccaaatgc acatacgtgt accgattctc 181 aacattgtgt caaggcagca acatgtactg ggtctacaga ttgtaataca gccaggacgt 241 gtacaaactc aaaagactgt tttgaagccg caacatgtac tgactcaacc aactgttaca 301 aagctacagc ctgtacccat tcaacaggat gtcccggaca ttaagttttt ctattgtcaa 361 caataataaa acacaattac tgttatctaa gcttaaacat cctctgtatt gtttccgatc 421 tgtctctttg cctcccgagg atgataattt tgtactggga tcgaaaaggt tatcggacaa 481 taataattaa taaactaaaa taattgataa aaaaaaaaaa aaa 目的基因编码的氨基酸序列（/gorf/gorf.html）： Atggcattcttaacgtgtggtttttcaaaaaaatggttagtaata M A F L T C G F S K K W L V I gcagttatagttatgtgcttgtgtaccgagtgttattgccaatgc A V I V M C L C T E C Y C Q C actgggggttctgattgtactagttgtacagcagcatgcactggt T G G S D C T S C T A A C T G tgtggaaactgtccaaatgcacatacgtgtaccgattctcaacat C G N C P N A H T C T D S Q H tgtgtcaaggcagcaacatgtactgggtctacagattgtaataca C V K A A T C T G S T D C N T gccaggacgtgtacaaactcaaaagactgttttgaagccgcaaca A R T C T N S K D C F E A A T tgtactgactcaaccaactgttacaaagctacagcctgtacccat C T D S T N C Y K A T A C T H tcaacaggatgtcccggacattaa S T G C P G H * 在NEB的REBASE数据库查找酶切位点。 用NEBcutter V2.0 查找mRNA内部所有酶切位点（查询网址：/NEBcutter2/index.php）： 用NCBI中 Primer-BLAST在线设计引物： 上游引物：5’-ATGGCA