[医药卫生]细胞培养总结.pptVIP

细胞培养 原代培养（略） 传代培养 一、准备事项 实验用品的洗涤 橡胶，塑料用品 步骤 玻璃器皿 玻璃器皿 溶液的配制 PBS RPMI1640培养基 消化液 冻存液 MTT 其它溶液 PBS配制 之后，加1000ml三蒸水,调节PH值在 7.2-7.4之间,高压121 ℃ ,30分钟,4℃备用。 RPMI1640培养基的配制 消化液的配制 称取胰蛋白酶粉0.5克，溶入PBS缓冲液200ml， 混匀，调整PH值到7.2， 过滤除菌，用1.5ml的EP管分装，-20℃冻存。 取少许放入已培养的无污染的培养基中 培养。 冻存液的配制 高压过的二甲基亚砜DMSO，胎牛血清和无血清培养基按1:4:5的比例配制。 例如配制10ml的冻存液： 高压的小瓶中加4ml过滤的胎牛血清，再加5ml培养基，最后加1ml的DMSO,混匀即可。 噻唑蓝MTT液配制 血清灭活 把血清置于56℃的水浴锅里待完全溶解后开始计时，30分钟后分装成20ml的小瓶，放-20℃备用。 超净工作台 换液（1） 把细胞培养瓶从培养箱中拿出 拧紧盖子 换液（2） 换液（3） 拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取出，烧瓶口（至少10圈） 传代（1） 传代（2） 传代（3） 传代（4） 冻存（1） 冻存（2） 冻存（3） 冻存（4） 复苏 MTT MTT法（1） MTT法（2） MTT法（3） 细胞计数 方法 吸出细胞悬液少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。 静置三分钟 镜下观察，计数板四大格细胞总数。公式为：细胞数/ml=四大格细胞总数/4 ×104个 注意 镜下见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算; 若细胞团数量占10%以上，重新制备细胞悬液。 计数时，计左侧和上方的压线细胞，右侧和下方的压线细胞不应该计在本方格之内。 实验开始前，96孔板应在超净台紫外灯下照射2个小时以上 从培养箱中拿出培养瓶，观察，加PBS，加胰酶消化，加培养基，计数 加培养基，调整细胞浓度为10000个/200μl 加到96孔板内,每板6行8列共48孔,每孔200μl 盖上96孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微镜下观察，标明名称，序号和日期 1 2 3 4 5 1 6. 用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养24小时。 7. 从培养箱中取出，镜下观察，拿到工作台内， 用200μl的枪将孔内的培养基吸出； 8. 加入不同浓度的药物的无血清培养基,每孔200μl。 9. 盖上96孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微镜观察，用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养24小时。 10.从培养箱中取出，镜下观察，拿到工作台内，每孔加MTT液20μl。 6 7 8 9 10 盖上96孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微镜下观察，用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养4小时 取出96孔板，倒掉孔内的液体，每孔加 DMSO150μl，放入酶标仪内，振荡600秒， 读数即可 11 12 * * 中生网收集整理，版本归属原作者。 一、准备及 注意事项 二、换 液 三、传 代 四、冻 存 六、MTT 五、复 苏 （1）橡胶，塑料用品 （2）玻璃器皿 等水开时开始记时 三十分钟后取下 倒掉烧杯内的水 自来水冲洗3遍 蒸馏水冲洗2遍 放烤箱下层中烘干 浸泡在５％盐酸中 至少30分钟 用自来水冲洗后 放入专用烧杯内 加入蒸馏水 使之淹没物品稍许 放在电炉上加热 将盐酸倒掉 用自来水冲洗十遍 蒸馏水冲洗三遍 放入烤箱上层烘干 放入饭盒内高压 放烤箱上层再次烘干 A B C 1 2 3 4 冲洗20遍后放入烤箱烘干 放入清洗缸即酸缸内，让整个器皿没入清洗液中 时间为过夜或者至少8个小时以上 取出器皿，用自来水冲洗十遍，放入烤箱上层烘干 取出器皿，高压后，放烤箱上层，再次烘干即可使用 8.00 0.20 3.49 0.20 NaCl KCl Na2HPO4.12H2O KH2PO4 质量(单位:克) 名称 取一小袋1640培养粉，加高压过的三蒸水800ml，在1000ml的烧杯中用玻璃棒搅拌溶解 加碳酸氢钠2.0g，再加三蒸水定容至1000ml 加青霉素(100U/ml) ，链霉素（100μg/ml） 在超净工作台内过滤除菌，分装成180ml，-20℃备用 方法 原理 活细胞的线粒体的乳酸脱氢酶可使MTT（黄绿色）分解，产生兰紫色结晶状甲赞颗粒，积淤细胞内和细胞周围；其量与细胞数成正比，也与细胞活力成正比。 MTT法只能测定细胞相对数和相对活力, 不能测定细胞绝对数. 注意 称取25mgMTT, 加入