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（3）PCR引物设计 中山大学药学院 PCR引物的设计原则 1 PCR的引物设计 PCR引物的使用 引物的在线设计工具及免费软件简介 中山大学药学院 PCR引物的设计原则 杜绝互补区域的存在 引物序列和靶序列各自内部应杜绝互补区域的存在。 为扩增后操作提供便利条件 在不影响扩增反应特异性的前提下，可在引物的5’端引入诸如限 限制性内切酶识别位点、启动子序列等有用的非模板序列，以便于扩 增后操作。 PCR引物的设计原则 引物与模板的互补程度 在一般情况下，并不要求引物与模板的序列达到100%互补，但 检查靶序列上其它可能存在的引物同源区域 为了减少PCR扩增产物的污染本底，在设计引物序列时应检查模 板DNA上是否存在潜在的引物同源区域。 尽可能高的互补程度是必要的。 PCR引物的设计原则 选择内含子序列作为引物序列 在真核生物中，即便是在重复基因的不同家族成员之间，其内含 引物的末端序列 在引物的两端设置1-2个嘌呤碱基，最好在引物的3’端避免G或C 这样可以在聚合反应开始时增加引物后面碱基掺入的机会。引物3’端 子序列也是随机多样性的。 至少应有1-2个碱基必须是特异性的。 中山大学药学院 引物实际设计 人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃， Tm值要相近，每条10-50pmol /100?l （1）靠近5上游Primer与双链DNA正链相同 3‘下游Primer与双链DNA正链互补，与负链相同 正链5————— 3 ——上游Primer ——下游Primer 负链 3————— 5 5 3 ＋ － 上游Primer 下游Primer 例如： IL-3正链 5GCTCCATGACCCAG-----------CGATCTTTTGAGTCCAA 3 负链 3CGCTAGAAAACTCAGGTT 5 上游~： 与其相同 下游~： 先写出相应负链3→5然后倒过来5→3 所以负链Primer：5-TTg gAC TCA AAA gAT CgC -3 中山大学药学院 （2）Primer 本身不要出现内部互补序列 形成loop环，内部二级结构 如： GGGTCGATTCCTACCCATGC （3）注意减少Primer间互补序列 导致2个Primer形成dimer 一般不要超过3个互补bp 如：CCCATGC ATGGAGTC : : : : : : : : GGGTCTA TCAGTAAGC 中山大学药学院 中山大学药学院 （4）Primer 5’未端可修饰、突变 修饰 如：32P、生物素、荧光素，不影响其效果 突变： AGCTCCATGACCCAG 5CGCTCCATGACCCAG 3 5‘Dig-GCTCCATGACCCAG 3 5‘Biotin-GCTCCATGACCCAG 3 注意：绝不可以在3端进行上述改造 ∵DNA聚合酶是5→3聚合，若3端改造→不能互补→不能延伸 RT时，引物设计3种方法 a：Random 9mers； b：Oligo dT-Adaptor Primer； c：特异的下游引物。 如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。 如果用c方法，要去查它的序列 中山大学药学院 AAAAAAA 5’ 3’ TTTTTTTT 5’ 3’ mRNA 总cDNA Oligo dT-Adaptor Pri