[理学]第12章-1 重组DNA技术.pptVIP

第12章 重组DNA技术 本章内容提要 1) 重组DNA与限制性内切酶 2) 大肠杆菌质粒克隆载体的结构 3) 如何构建基因文库 4) 分子杂交的原理与程序 5) 如何从基因文库中筛选基因 什么是重组DNA? 分子刀-DNA限制性内切酶 限制性内切酶是一类在原核生物中发现的可以识别 特定的DNA碱基顺序并将其切开的酶. 限制性核酸内切酶的特点 1) 限制性核酸内切酶仅在原核生物中发现. 2) 限制性核酸内切酶识别的碱基顺序长度不等, 可从4 碱基对到数十碱基对. 大多数常用的限制酶识别 的碱基对长度为4-6个碱基对. 3) 限制性核酸内切酶切割DNA的方式可以是5’突出单 链或3’突出单链, 也可以是平端酶切. 4) 大多数II型限制性核酸内切酶识别的碱基顺序都有 回文对称的特点, 即旋转1800, 识别顺序重叠. 5) 细菌中的限制核酸内切酶可以将外源的DNA切割,但 不酶切自身的DNA. 因为细菌基因组DNA可以甲基化, 使限制酶不能识别而得以保护. 发现限制性内切酶 1) 1950年代科學家發現了大腸桿菌K具有某種機制可以 限制λ噬菌體的感染能力. 2) 1962年瑞士的科學家Werner Arber等人證明了大腸桿 菌K可以產生一種酶，可以阻止λ噬菌體的感染能力, 因而稱為限制性内切酶 (restriction endonuclease ). 3) 在1970年美國科學家Hamilton O. Smith等人从噬血感 菌RD菌株中分離出另一種限制酶, 定名為Hind II, 为 II 型限制酶, 目前常使用的限制酶均屬於這一類 . 4) 在1971年美國科學家Daniel Nathans等人，首先利用 Hind II限制酶描繪出?simian virus 40(SV40)病毒的限 制酶位点物理图. 基於限制酶的發現及其性質方面研究的貢獻，Werner Arber、Hamilton O. smith、Daniel Nathans三人在1978 共同获得諾貝爾生理醫學獎。 限制酶发现及其应用获得诺贝尔奖 有三种限制性内切酶 目前已知有三种限制性内切酶: 1) I型限制性内切酶: 一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的蛋白复合体, 可催化宿主DNA的甲基化 。它们在识别位点約1000bp以外的任何位置切割DNA链, 不产生确定的限制片段和明确的条带. 2) II型限制性内切酶: 在识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链。它们产生确定的限制片段和条带，因此是三类限制性内切酶中唯一用于DNA分析和克隆的酶。 3) III型限制性内切酶: 兼有限制和修饰两种功能的酶,可催化宿主DNA的甲基化 。它们在识别位点之外25-27 bp的位置切开DNA链，并且要求识别位点是反向重复序列, 如Bcg I, CGANNNNNNTGC ；它们很少能产生完全切割的片段，因而不具备实用价值。 几种常用的II型限制酶及其识别位点 限制酶识别与酶切的碱基顺序具有回文结构, 旋转1800C 可以顺序重叠, 产生的突出末端称为粘性末端. 平端切口 不产生突出单链末端. 重组DNA的操作 限制酶切割DNA暴露的突出末端顺序又称粘性末端, 具有 相同突出末端的片段可以彼此连接. 第一个重组DNA分子 1972年斯坦福大学的Paul Berg博士首次在国际上构建第 一个重组DNA分子, 它们结合了 两种生物的DNA.为此, Berg荣 获1980年化学诺贝尔奖. 重组 DNA与原子核裂变的意义可以相 提并论. 上世纪70年代中期, 美国国家科学院要求Berg就重组DNA的安全性进行 评估.为此, Berg写了一封具有历史意义的信件, 号召 推迟重组DNA研究, 直到安全性得到控制为止. 他是 1975年在加洲Asilomar召开的国际重组DNA技术 论坛的关键组织者.一百多位与会科学家讨论了基因 剪切实验的潜在风险.一年后, 讨论结果形成了关于重 组DNA技术的NIH准则, 这是一个里程碑式的事件,显 示了科学家们负责任的自律精神. Berg博士1991年 被聘为人类基因组计划