基因引物设计教材教学稿件.pptVIP

* 常用实验技术简介 黄雪娜 2011-8-4 目 录 全长cDNA克隆 引物设计 染色体步移技术 注意事项： 高质量的mRNA和高效率的逆转录； 加大引物浓度； 选择mRNA表达量高的组织做模板； 梯度PCR或者降落PCR； 巢氏PCR; 序列分析； 3’RACE: 原理： 5’RACE 原理： 注意事项： RNA的完整性； 高效的逆转录酶； 多次5’RACE相结合； 应用丰度高的组织做模板； 长片段扩增应用LA-Taq酶； 同源克隆方法； 用随机引物或者OligoT引导逆转录； 序列分析 引物设计：Primer 5.0； 一般的序列处理：DNAStar中的Editseq； 序列拼接： DNAStar中的Seqman、BL2； 序列在线比对：NCBI-BLAST ( / )； 序列多重比对：Bioedit、ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)； 寻找ORF: Editseq、ORF Finder ( /gorf/gorf.html )； 序列作图：Bioedit、EMBOSS ( http://emboss.bioinformatics.nl/ )； 构建进化树:MEGA 4.1； 蛋白结构域分析：SMART( http://smart.embl-heidelberg.de/ )； 蛋白理化性质分析及二、三级结构分析：EXPASY( http://www.expasy.ch/tools/ )、Psipred ( http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/ )； 信号肽分析：SignalP( http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ )； 磷酸化位点分析：NetPhos 2.0 Server ( http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/ )； 糖基化位点：NetNGlyc 1.0 Server ( http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ )； 引物设计 兼并引物 RACE引物 荧光定量引物 染色体步移引物 原核表达用引物 PCR-SSCP引物 选择合适的序列进行多重比对； 选择高度保守的序列作为引物； 人工设计时要注意引物序列是和原序列相同还是反向互补的； 简并度不能太高，可用次黄嘌呤代替N； 引物的3‘端残基尽可能使用确定残基 ； 降落PCR; 巢氏PCR; RACE引物 各3条重叠的引物，引物之间最好距离100-200bp； 若同源片段长度太短，可先做3’RACE，再做5’RACE； 尽量靠近cDNA末端（3’RACE-3’末端； 5’RACE-5’末端）； 荧光定量引物 纯化方式：PAGE； 产物长度：80-150bp； TM值:58-62; 在编码区内靠近3’末端处设计； 高的特异性：测序及熔解曲线分析； *