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2.间接法 是直接的重要改进，先用标记的已知特异性一抗与组织细胞内抗原结合，随后用间接荧光标记二抗与一抗特异性结合。 操作流程 (1)冰冻切片经固定，凉干后PBS洗；石蜡切片脱蜡至水，PBS洗，酶消化，PBS洗3×3min。(2)适当稀释特异性一抗，37℃孵育1h，或室温4h，或4℃过夜，PBS洗3×3min。 (3)荧光标记二抗适当稀释37℃ 30min，PBS洗3×3min。(4)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min，PBS洗3×3min。(5)封片，镜检。 六、荧光显微镜检查方法 1.荧光显微镜 荧光显微镜是免疫荧光组织化学的基本工具。它是由超高压光源，滤片系统(包括激发和压制滤板)，光学系统和摄影系统等主要部件组成，是利用一定波长的光激发标本发射荧光。 (1)光源 光源的亮度应根据荧光素的类型选择。小功率汞灯可满足激励一般荧光染料的要求。对于免疫荧光染色需用大功率超高压汞灯。其工作时，两个电极间放电，引起球内水银蒸发，经过5～15min，球内气压升至50～70标准大气压，此时达到最高亮度，成为稳定工作状态。 (2)滤片系统 是荧光显微镜的重要组成部分，是获得特定波长光，清晰的荧光影像和发挥显微镜最佳性能之关键。了解滤片性能，正确地选择滤片是观察荧光效应的前提和必要条件。 滤片系统包括激发滤片，阻断滤片、隔热滤片，分光镜和其他一些中性滤片。 荧光显微镜的滤片系统 激励法 分光镜 激发滤光片 截止滤光片 用途 U DM400 BP330-385 BP360-370 BA420 自动荧光观察法，DAPI(联脒基吲哚)：DNA Hoechest 33358,33342染色体 V DM455 BP400-410 BA455 儿茶酚胺观察 BV DM455 BP400-440 BA475 芥子喹吖因；染色体 BP420-440 硫磺素S：淋巴细胞 吖淀黄素：核酸 B DM500 BP450-480 BA515 异硫氰酸荧光素：荧光抗体观察 BP470-490 吖啶橙：DNA，RNA BP420-480 金胺结核杆菌 IB DM505 PB460-490 BA515IF BP470-490 G DM570 BP510-550 BA590 罗丹明 BP530-550 四甲基罗丹明异硫氰酸盐：荧光抗体观察 BP480-550 碘化丙啶：DNA IG DM565 BP520-550 BA580IF DM600 BP545-580 BA610IF 德克萨斯红：荧光抗体观察 2.标本制作要求(1)载玻片厚度应在0.6～1.2mm之间(2)盖玻片应光洁，厚度在0.17mm左右(3)标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不能充分激分。 (4)封片剂 常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。甘油和0.5mol/L pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液等量混合作封片剂。 荧光信号增强封片剂 mowiol 40-88 4.8g 甘油 12ml 蒸馏水 12ml 0.2mol/L Tris(pH8.5) 24ml 上述混合（加热溶解），5000g离心，15min，最后加入1.4-diazobicydo-[2,2,2]-octane(DABcos)，终浓度2.5%(约1.25g)，溶解后，分装存于-20℃中。(5)镜油 3.使用荧光显微镜注意事项(1)严格按说明书操作，不要随意改变程序。(2)应在暗室中进行检查。(3)防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源时应戴上防护眼镜。(4)检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯强度逐渐下降，荧光减弱。 (5)荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。光源关闭后必须在30min后才能再启动光源，一天中应避免数次点燃光源。 (6)标本染色后应立即观察。(7)荧光高度的判断标准，分四级“ －”为阴性，“ ＋”为仅能见明确可见的荧光；“ ＋＋”为可见有明亮的荧光；“ ＋＋＋”为可见耀眼的荧光。 七、非特异性染色的消除方法根据产生的原因采取适当的方法，常用方法： 1.动物脏器粉末吸收法 2.透析法 3.Sephadex G-50柱层析法 4.DEAE纤维素柱层析法 5.荧光抗体稀释法 6.纯化抗原方法 7.纯化抗体方法 8.伊文氏蓝衬染方法：0.01%伊文氏蓝 第六讲免疫荧光组化技术 主要内容 一、荧光的特征 二、荧光素 三、荧光素标记抗体的方法 四、荧光抗体的质量鉴定 五、免疫荧光组