免疫测定方法学和临床应用PPT.ppt

免疫测定方法学临床应用;免疫分析技术简介 乙肝病毒标志物定性、定量检测常见问题 抗HCV检测问题 ANA.ENA检测问题 TP-Ab检测问题 TB-Ab检测问题;免疫分析技术; 待测物质浓度与检测手段;放射免疫的创立;放射免疫的精髓;新技术的挑战;标记免疫方法;自动标记免疫分析的优点;乙型肝炎病毒;定性？定量？;定性测定结果确定的依据;定性免疫测定的CUT-OFF值与灰区SD1=0.019 SD2=0.628;可疑阳性处理原则;定量测定结果的依据;定性测定与定量测定分别;Elecsys 与酶免法的主要区别;丙型肝炎的实验室诊断;;;一、抗-HCV IgG检测;酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA);HCV不能体外培养,大量HCV天然抗原几乎得不到.目前主要用基因工程表达和多肽合成方法得到。 用什么区段的丙肝病毒抗原蛋白？如何选择各种抗原合适的比例？是保证HCV试剂测出样品中所有的抗-HCV抗体的关键。; 抗体 ;第一代抗-HCV检测系统; 主要缺陷是： 灵敏度低,漏检率较高：C100只含363个氨基酸,只代表整个HCV抗原抗体系统的一小部分； 抗体检出时间较晚：不适于早期诊断。 非特异性反应较高：使用的抗原含SOD融合蛋白,因此,当人体存有抗-SOD时常常出现假阳性。 ;第二代抗-HCV检测系统; 不足： 由于重组基因多肽抗原中仍有SOD多肽,所以仍存在抗-SOD造成的假阳性问题,于是激发人们建立人工合成肽段检测抗-HCV的新试剂。 ;第三代抗-HCV检测系统; 目前我国多采用第三代抗-HCV ELISA试剂,其敏感性超过99%,虽然目前缺乏判断其敏感性的金标准,但对于免疫功能正常的HCV RNA阳性感染者,抗-HCV检出率也高于99%。 ;补充/确认实验:重组免疫印迹 (RIBA);因为HCV的各种抗原分别被单独固化在载体的不同位置上,因此,该项检测可以区分待测样品对HCV不同抗原的不同反应。 目前RIBA HCV已经得到FDA的认可,成为抗-HCV确认的标准。 临床意义：RIBA阳性的患者中75-80%为病毒血症(HCV RNA);RIBA阳性而血清中没有HCV RNA时提示可能为既往感染。; 实时荧光监测PCR 检测原理：在PCR扩增反应管内加入了标记有两种染料的针对靶序列的探针,每当一次扩增反应中一条探针与靶序列退火结合后,整个反应体系就会增加一个单位的荧光.从而得出每一次扩增循环结束后产物的量.; 临床意义： 特异性强：抗-HCV阳性并不能代表现症感染,丙型肝炎的诊断标准是HCV-RNA. 敏感性高：可发现抗-HCV阴性者HCV感染. 阳性出现早：在“窗口期”没有抗-HCV产生,但可检测出RNA. 可指导用药：为疗效观察及预后判断提供指标.; 与HBV DNA相比，HCV RNA检测更为复杂和困难,检出率低: 血清中病毒含量低,且有一定波动,呈间歇阳性; 易被RNA酶降解; HCV RNA受进食的影响,HCV易与血中脂质及脂蛋白结合,致使其检出率降低; 二次PCR,其中任何步骤的问题均易影响其检出。 ;应用EIA S/CO比值报告抗-HCV结果; ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ;ANA ENA 测定;ANA.ENA-Abs;欧蒙斑点法(EuROAssAY) ;结果判断简单，可靠 · 不需特殊仪器，肉眼判断结果 · 由于把抗原包被在固定的位置判断实验结果比免疫印迹法简单，更适合常规检测 · 反应区的质控带呈显较深的颜色反应说明操作正确。 · 阴阳性结果差别明显。条带显色的深浅与抗体滴度相关。 · 抗原经亲和层析分离纯化。膜条上没有多余蛋白，不会产生非特异性反应。 · 反应过的载片可长期保存，试验结果容易存档。 ;ENA多肽抗体谱（免疫印迹法） ;需注意问题;关于标准带的误差 ;梅毒螺旋体(TP);梅毒螺旋体非特异性抗体与TP特异性抗体检测的关系;ELISA-TP（+）处理;49